基因敲除ACE2细胞系

ACE2血管紧张素转换酶2（一种血管紧张素转换酶（二肽羧肽酶家族的ACE样核酸外切酶）主要在心脏，肾脏和睾丸的血管内皮细胞中表达。羧肽酶血管紧张素转换酶2（ACE2）将八肽血管紧张素（Ang）-II水解为七肽Ang-（1-7），对血糖具有重要的保护作用。 ACE2基因敲除小鼠对葡萄糖的反应是耐量降低和胰岛素分泌受损。相反，为胰腺提供ACE2基因治疗可以改善db / db小鼠血糖和原代细胞功能，这是肥胖症诱发的糖尿病常见的遗传模型。

TALEN的RNA转染产生了远距离的Ace2基因敲除小鼠，表明结肠炎让人联想到病理生理学和炎症

血管紧张素I转换酶2（ACE2）是维持肠道稳态的关键因素。体内稳态障碍会导致结肠发炎（结肠炎），从而导致危及生命的虚弱甚至癌症。动物模型是解读此类人类疾病背后的病理学和筛选假设的治疗靶点或范例的有价值的替代方法。但是，疾病模型的开发可能很耗时并且需要技术，这可能会影响其应用价值。在这项研究中，我们直接将体外转录的编码转录激活子样效应子核酸酶（TALENs）的mRNA注入远交昆明小鼠受精卵的细胞质中，从而遗传破坏了小鼠Ace2基因。因此，诱导体细胞突变的效率为57％，其中39％为移码突变。而且，所有修饰在种系传递过程中均稳定转移。在Ace2基因敲除技术，系雄性小鼠（Ace2- / y）中，研究人员观察到严重的化学诱导性结肠炎，其特征在于体重减轻，腹泻和结肠长度缩短。从组织学上讲，Ace2突变会引起白细胞浸润并严重破坏肠粘膜屏障。此外，研究人员发现，Ace2- / y小鼠结肠组织中炎性细胞因子的表达增加。总体而言，数据显示通过合体注射TALEN mRNA，可以在杂种小鼠模型中实现高靶向效率和遗传性。另外，所得的Ace2-// y小鼠表现出让人联想到结肠炎的表型特征，并且研究人员期望这种小鼠在肠道微生物组或粪便移植的研究中可能具有价值。

ACE2/血管紧张素（1-7）/ Ma轴在骨肉瘤细胞U-2 OS和MNNG-HOS中的表达和功能

肾素-血管紧张素系统（RAS）通过其经典的血管紧张素转换酶（ACE）/血管紧张素II /1型受体（AT1R）轴转移与各种实体瘤的增殖作用。在骨肉瘤的小鼠模型中，AT1R阻滞剂可以减少肿瘤体积，并减少肝和肺转移。替代性ACE2 / Ang（1-7）/ Ma轴在骨肉瘤中的表达和功能仍有待研究。在这项研究中，分析了替换RAS轴的基本成分和白介素（IL）-1β刺激的表达，并研究了Mas对U-2 OS和MNNG-HOS骨肉瘤细胞增殖和/或迁移的影响。研究聚合酶链反应显示这两个细胞系均表达Ang（1-7）肽酶ACE2，中性内肽酶24.11，脯氨酰-内肽酶和Ang（1-7）。身体Mas。 IL-1β诱导Mas  mRNA和蛋白的表达，这与增殖和迁移的减少有关。相反，小的干扰RNA介导的Mas表达的敲低导致细胞增殖增加。总之，骨肉瘤细胞表达ACE2 / Ang（1-7）/ Mas轴的功能活性替代。通过减少生长并预防癌症转移，该轴的诱导和增强可能对骨肉瘤的治疗有益。这些作用可以通过直接施用Mas激动剂来实现，也可以通过ACE抑制剂或AT1R拮抗剂阻断经典的AngII RAS轴来间接实现。

血管紧张素II通过p38丝裂原激活的蛋白激酶和细胞外信号调节激酶1/2信号传导调节神经元中的ACE和ACE2

脑ANG II在调节交感功能和体内平衡中起重要作用。 ANG II的产生和降解在很大程度上分别通过血管紧张素转化酶（ACE）和ACE2进行。在疾病状态，例如高血压和慢性心力衰竭中，ACE的中央表达上调，而ACE2在中央交感神经元中减少。在这项研究中，研究人员确定了神经元细胞培养物中ACE和ACE2对ANG II的反应及其后续信号传导机制的表达。小鼠儿茶酚胺能神经元细胞系（CATH.a）用ANG II（30、100和300 nM）处理24小时，并通过蛋白质印迹分析确定蛋白表达。 ANG II诱导了CATH.a神经元中ACE的剂量依赖性显着增加以及ACE2 mRNA和蛋白表达的降低。在给予ANG II或ERK1 / 2抑制剂U-0126（10μM）之前30分钟，用p38 MAPK抑制剂SB-203580（10μM）对细胞进行预处理，从而消除了这种作用。这些数据表明，ANG II通过ANG II 1型受体，p38 MAPK和ERK1 / 2信号通路增加ACE并减弱神经元中ACE2的表达。

由Ubigene开发的CRISPR-U™（基于CRISPR / Cas9技术）在双链断裂方面比普通CRISPR / Cas9更有效，而CRISPR-U™可以大大提高同源重组的效率，轻松实现敲除（KO） ），体外和体内的点突变（PM）和敲入（KI）。借助CRISPR-U，Ubigene已成功编辑了100多个细胞系上的基因。

Reference

Liu, C., Xiao, L., Li, F. et al. Generation of outbred Ace2 knockout mice by RNA transfection of TALENs displaying colitis reminiscent pathophysiology and inflammation. Transgenic Res 24, 433–446 (2015). 

Ender SA, Dallmer A, Lässig F, Lendeckel U, Wolke C. Expression and function of the ACE2/angiotensin(1-7)/Mas axis in osteosarcoma cell lines U-2 OS and MNNG-HOS. Mol Med Rep. 2014;10(2):804-810. doi:10.3892/mmr.2014.2266

Xiao L, Haack KK, Zucker IH. Angiotensin II regulates ACE and ACE2 in neurons through p38 mitogen-activated protein kinase and extracellular signal-regulated kinase 1/2 signaling. Am J Physiol Cell Physiol. 2013;304(11):C1073-C1079. doi:10.1152/ajpcell.00364.2012。

基因敲除切割效率不仅可以让人具有生成蛋白基化谱和建立调控记录的能力，而且具有多种优势，是一种特别有吸引力的重组蛋白表达系统。首先，它在谷氨酸上羧基化，在酪氨酸上硫酸化。第二，操作简单，通过瞬时基因表达可以快速产生重组蛋白。第三，可用于稳定的重组蛋白生产。一些研究人员利用基因细胞敲除切割效率系统产生基因编辑细胞系，对GLUL基因组位点进行靶向测序，产生了EPO的稳转细胞系，并发现重组促红细胞生成素在人体内稳定表达的机制。

源井生物根据客户需求，结合靶基因的情况进行基因稳转敲除方案设计。

方案1：小片段基因敲除方案，gRNA设在外显子2两端的内含子中，敲除外显子编码碱基数为非3倍数，敲除后可造成移码。