基因敲除酵母thg1

在日常生活中有三个区域可以鉴定出与酵母tRNA（His）鸟苷基转移酶（Thg1）具有序列相似性的基因，Thg1家族酶涉及从tRNA（His）成熟到5'端修复到基因敲除等多种过程。 tRNA的所有这些活动中都利用了Thg1家族酶催化3'-5'核苷酸的加成反应能力。尽管许多含Thg1的生物中只有一个与Thg1相关的基因，但某些真核微生物却拥有与Thg1序列相似的多个基因。

细菌tRNAHIS鸟苷基转移酶（Thg1）样蛋白的结构研究，在激活和核苷酸转移位点中具有的基因编辑技术

所有核苷酸聚合酶和转移酶均在5'至3'方向中催化核苷酸的添加。相反，tRNAHis胍基转移酶（Thg1）酶催化核苷酸向多核苷酸底物的反常添加（3'至5'）。在真核生物中，Thg1酶利用3'–5'附加活性将G-1添加到tRNAHis的5'末端，这是组氨酸-tRNA合成酶对tRNA进行有效氨酰化所必需的修饰。 Thg1样蛋白（TLP）基因敲除大肠杆菌和线粒体中发现，并且在生化上不同于其真核Thg1对应物TLP催化截短的tRNA的5'端修复，其作用于广泛的tRNA底物，而不是表现出严格的特异性tRNAHis。两者合计，knockout bacteria这些数据表明TLPs在tRNAHis成熟途径的不同生物学的过程中起作用，也许在tRNA质量控制中。研究人员介绍了来自革兰氏阳性土壤细菌苏云金芽孢杆菌（BtTLP）的TLP的第一个晶体结构。该酶是类似于人THG1的四聚体，与它具有基本的结构相似性。用5'-单磷酸化的tRNA催化3'-5'反应首先需要一个激活步骤，即在第二个核苷酸基转移步骤之前生成5'-腺苷酸化的中间体，其中核苷酸被转移到tRNA的5'-末端。与人类THG1的早期特征一致，研究人员观察到了激活和核苷酸转移这两个步骤中涉及的核苷酸的独特结合位点。具有GTP的BtTLP复合物揭示了与GTP核苷酸在激活位点的新相互作用，这从先前解析的结构中看不出来。此外，BtTLP-ATP结构允许首次在激活位点直接观察ATP。 BtTLP结构数据，结合所选变体的动力学分析，提供了对关键残基在激活步骤中的作用的新见解。

酿酒酵母Thg1使用5'-焦磷酸盐去除控制核苷酸向tRNA的添加

在真核生物中，tRNA（His）鸟苷基转移酶（Thg1）催化3'-5'将单个鸟苷残基添加到tRNA（His）的-1位（G-1），跨过高度保守的73位腺苷（ A73）。加入G-1后，Thg1从tRNA 5'末端去除焦磷酸，生成5'-单磷酸化含有G-1的tRNA。 5'-单磷酸化的G-1残基的存在，对于通过其组氨酸-tRNA合成酶识别tRNA（His）非常的重要。除单G-1加成反应外，Thg1还将多个G残基聚合到tRNA（His）变体的5'端。对于3'-5'聚合，Thg1使用tRNA（His）受体茎的3'末端作为模板。推测逆向聚合的机理涉及每个传入的NTP对3'-OH的亲核攻击，该3'-OH对通过前面的核苷酸添加而产生的完整5'-三磷酸酯进行了攻击。在5'-焦磷酸盐去除的3'-5'聚合酶反应之间存在竞争潜力，这可能确定了Thg1催化加成反应的结果，但尚未研究出任何Thg1酶在这些竞争反应之间的相互作用。研究人员建立了瞬态动力学测定法，以鉴定酵母Thg1具有一组tRNA（His）底物的焦磷酸盐去除与核苷酸添加了活性之间的关系，其中N-1：N73碱基的身份发生变化，以模仿N-1的各种产物Thg1催化的加成反应。研究人员证明5'-三磷酸的保留与有效的3'-5'逆向聚合相关。提出了一种动力学分配机制，该机制可防止野生型tRNA（His）-1位以外的核苷酸添加。

Thg1型3'-5'核酸聚合酶中经典RRM折叠棕榈结构域的存在以及GGDEF和CRISPR聚合酶结构域的起源

使用敏感的分布图比较结构预测的方法，我们显示出催化结构域Thg1包含RRM（铁氧还蛋白）折叠棕榈结构域，就像病毒RNA依赖性RNA聚合酶，逆转录酶，A和B族DNA聚合酶，腺苷酸环化酶，双鸟苷酸环化酶（GGDEF结构域）和CRISPR系统的预期聚合酶。研究人员表明，就像在这些聚合酶中一样，Thg1拥有一个带有三个酸性残基的活性位点，这些酸性残基螯合Mg ++阳离子。根据该研究人员的预测，Thg1类似于5'-3'聚合酶催化聚合反应，但利用传入的3'OH攻击延伸的多核苷酸末端生成的5'三磷酸。此外，研究人员还确定了Thg1独特这一组独特残基，研究人员预测这些残基包含第二个活性定位点，该位点催化最初的腺苷酸化引发了3'-5'聚合反应。从看到的信息显示来自保守基因邻域的背景Thg1资料，研究人员表明Thg1可能与多核苷酸激酶结合起作用，该多核苷酸激酶在RNA分子末端为其生成初始5'磷酸底物。除组氨酸tRNA成熟外，Thg1在生命的所有三个超级区域以及某些大型DNA病毒的代表中可能还具有其他RNA修复作用。研究人员还提供证据表明，在类似聚合酶的结构域，证实两人Thg1与GGDEF和CRISPR聚合酶蛋白催化结构域的密切相关。

根据这种关系和这些酶的系统发育模式，我们推断Thg1蛋白很可能代表同一类蛋白质的古生真核分支，从而产生了可移动的CRISPR聚合酶，并在细菌中产生了GGDEF结构域。 Thg1可能接近该酶家族的祖先版本，后者在最后一个通用祖先中可能在RNA修复中发挥了作用。

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Reference

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方案1：小片段基因敲除方案，gRNA设在外显子2两端的内含子中，敲除外显子编码碱基数为非3倍数，敲除后可造成移码。