一种提高植物RNA靶向效率和基因编辑效率的高效表达载体

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一种提高植物RNA靶向效率和基因编辑效率的高效表达载体

近日，江苏师范大学生命科学学院甘薯研究团队在植物科学权威期刊《Plant Biotechnology Journal》（2019年即时影响因子8.5）在线发表了题为《Improving CRISPR‐Cas‐mediatedRNA targeting and gene editing using SPLCV replicon‐based expression vectors inNicotiana benthamiana》的研究论文，论文开发了多种基于SPLCV复制子的高效植物表达载体，可显著提高LwaCas13a在植物中的RNA靶向效率，同时也能显著提高SpCas9/LbCas12a在植物中的基因编辑效率。

江苏师大生科院博士研究生余益成为该研究第一作者，硕士研究生王笑和徐州市农科院孙厚俊副研究员为共同第一作者，江苏师大生科院李宗芸教授和孙健副教授为该研究共同通讯作者，江苏师范大学为第一单位及通讯作者单位，徐州市农科院李强研究员、曹清河研究员、谢逸萍研究员、马代夫研究员、张成玲副研究员以及江苏省农科院边小峰副研究员作为合作作者参与了本项研究工作。

双生病毒（Geminivirus）是植物病毒中唯一的一类具有孪生颗粒形态的单链环状DNA病毒。根据双生病毒的滚环复制特性，可将其复制子改造成植物表达载体并进行高效外源基因表达，这一策略已应用于药用蛋白生产、植物基因沉默和植物基因编辑。尤其是在植物基因敲入研究中，双生病毒载体为高效递送同源重组修复模板提供了非常便利的工具。

甘薯卷叶病毒（SPLCV）是一种单组分双生病毒，可侵染甘薯、烟草、牵牛等多种双子叶植物。本研究对SPLCV-JS株系进行了重构，构建了一系列基于SPLCV复制子的植物表达载体（野生型和三种突变型载体），同时以本氏烟作为实验系统，比较了各种载体特性，并应用于CRISPR-Cas介导的RNA和基因编辑，获得以下重要实验结果：

（1）AC2m/AC4m双突载体的细胞致死性显著降低，失去RNA沉默抑制子作用，与野生型载体相比其表达外源基因的能力并无显著差异；

（2）与常规瞬时表达载体相比，AC2m/AC4m双突载体能够显著提高LwaCas13a及gRNA的表达水平, 其靶向外源RNA和内源RNA的效率从常规载体的30 %左右提升至70 %；

（3）AC4m单突载体的细胞致死性显著降低，但依然存在RNA沉默抑制子作用，该载体能够显著提高SPCas9和LbCas12a及相应crRNA的表达水平，平均突变率从常规载体的10 %左右提升至35 % 。

基于SPLCV复制子的高效植物表达载体的开发拓展了双生病毒载体在植物生物技术中的应用范围。AC2m/AC4m双突载体和AC4m单突载体更为重要农作物甘薯的分子育种（如基因敲入）和基础生物学研究（如叶片瞬时基因表达和沉默）提供了重要的工具。

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