这把新 “魔剪” 小巧却高效，基因治疗迎来 “理想型” 工具

在 CRISPR/Cas9 基因编辑治疗中，小型基因编辑工具可以搭载 AAV 病毒进入体内，是基因治疗的理想工具。不同型号的基因编辑工具是否适合用于基因治疗，取决于这把 “魔剪” 基因大小是否能搭载 AAV 病毒载体。

日前，复旦大学王永明课题组联合王红艳课题组从耳氏葡萄球菌中发现了一把小型的基因编辑工具并将其命名为 SauriCas9.这把玲珑的 “剪刀” 在基因组中可编辑的位点数量和经典的 SpCas9 一样多，而比另一种小型基因编辑工具 SaCas9 可编辑位点更多。该研究成果填补了我国在鉴定小型 CRISPR/Cas9 工具领域的空白。新的小型基因编辑工具的发现，弥补了现有基因编辑工具的不足。相关研究成果于近日在线发表于《公共科学图书馆：生物学》

兼具活性和编辑范围优势

第三代基因编辑技术 CRISPR 技术让基因治疗的研究迈上了一个新台阶。在自然界中，CRISPR/Cas9 系统是细菌的免疫系统，首先将入侵噬菌体和质粒 DNA 的片段整合到 CRISPR 中，然后表达出相应的 CRISPR RNA（crRNA）来指导同源序列的降解，从而提供免疫性。王永明告诉科技日报记者，CRISPR/Cas9 技术主要面临两个核心问题，一个是如何避免脱靶，另外一个是如何扩展编辑范围。新的小型基因编辑工具的发现主要针对后者展开的研究。

与其他小型基因编辑工具相比，SauriCas9 相当于一把灵活而锋利的小型 “剪刀”，能够包装在 AAV 病毒内，且活性高，同时能够实现比以往发现的小型基因编辑工具更大的编辑范围。SauriCas9 通过 AAV 病毒包装后，在多种细胞类型中实现了基因编辑，说明 SauriCas9 具有用于基因治疗的潜力。

“SauriCas9 基因大小为 3100 个碱基对，与另一种小型基因编辑工具 SaCas9 大小差不多，同时比经典的 SpCas9 要小 1000 个碱基对。SaCas9 比 SpCas9 小很多，但是编辑范围不如 SpCas9 大。” 王永明表示，SaCas9 来源于金黄色葡萄球菌，是第一个被用于基因治疗研究的小型基因编辑工具。另外还有 3 个小型编辑工具 NmCas9、Nme2Cas9、CjCas9，但是它们的编辑效率偏低。SpCas9 来源于化脓性链球菌，虽然编辑范围大，但是不能被包装在 AAV 病毒中，用于基因治疗面临困难。

基因编辑工具的来源不同，基因编辑范围和效率也不同。SpCas9 是所有基因编辑工具中效率最高的，同时编辑范围也大。“SauriCas9 出现两个连续的 G 序列就可以进行编辑，而 SaCas9 需要 4 个碱基组合才能编辑，这样出现的频率低，编辑范围就不如 SauriCas9 大。” 王永明说。

王永明课题组对公共数据库中的 30 个不同种类 CRISPR/Cas9 进行一一测试验证，发现其他 29 个 Cas9 均不适合用于基因编辑，只有 SauriCas9 具有编辑活性，很适合作为基因编辑治疗的工具。

用于药物靶点的高通量筛选

CRISPR/Cas9 系统包括两个元件，分别是 Cas9 内切酶和 guide RNA（gRNA），gRNA 引导 Cas9 蛋白在靶位点进行切割，形成 DNA 双链断裂（DSB）。细胞的修复系统修复双链断裂的 DNA 时，会定点产生突变，这就是基因编辑。以往 SpCas9 通过与氨基酸融合实现碱基转换。在发现了 SauriCas9 之后，研究团队将其与氨基酸融合制作了两种新的碱基编辑器——SauriCas9BE4max 和 SauriCas9ABEmax,分别可以实现 C-T 或 A-G 两种碱基转换。“由于 SauriCas9 可以识别更多的位点，其编辑器的修复范围也相应比 SaCas9 更大。” 王永明说。

CRISPR/Cas9 技术的安全性也是科学家研究的关注点，通常与基因编辑工具的精准度相关。据王永明介绍，基因治疗方式可以分为两种，一种是将细胞从体内分离出来，在体外进行突变纠正，然后再输回体内。另外一种治疗方式是将 CRISPR/Cas9 系统直接导入体内治疗疾病。但是 CRISPR/Cas9 技术可能会造成脱靶修饰，带来难以预料的风险。

SauriCas9 的精准度介于 SpCas9 与 SaCas9 之间。SaCas9 的精准度更好，意味着更具安全性。研究组将 SauriCas9 部分序列和 SaCas9 基因序列互换，得到了嵌合体 Cas9，保证了精准度的同时也能扩大编辑范围，使基因编辑工具得到了进一步优化。

后续的研究中，王永明课题组还将对新的基因编辑工具进行安全性测试验证，扩展其在高通量筛选等方面的应用。“人类大约有 2 万个基因，利用 CRISPR/Cas9 可以分别敲除这 2 万个基因，敲除过程可以用高通量实现，这样就可以快速研究这些基因的功能，为药物研发提供靶点。” 王永明介绍。