CRISPR 技术基因敲除细菌

科学家们已经开发出一种基于CRISPR-Cas9系统的连续基因敲除技术，包括单个和多个（最多三个）靶基因插入和敲除，目的是进行细菌修饰。 CRISPR/Cas系统是一种原核免疫。系统对外源遗传元件（例如在质粒和噬菌体中发现的那些）的抗性可以提供某种形式的获得性免疫。具有间隔序列的RNA可以帮助Cas蛋白识别和切割外源DNA。 RNA引导的其他Cas蛋白可以切割外源RNA。在大约40％的细菌基因组序列和90％的古细菌序列中发现CRISPR。

通过CRISPR-Cas9系统在基因敲除大肠杆菌中进行多次基因编辑

工业上有用的微生物的构建需要有效的基因组规模的编辑工具。研究人员描述了一种靶向，连续的多基因编辑策略，该策略使用化脓链球菌II型CRISPR-Cas9系统应用于大肠杆菌基因组，以实现多种精确的基因组修饰，包括基因删除和插入，效率最高是100％，它可以同时在三个目标上执行多基因编辑。该系统还证明，它成功地在另一种Enterobacteriaceae-Tatumella citrea中实现了靶向染色体缺失，效率高达100％。

使用CRISPR/Cas9在大肠杆菌中进行多个逐步基因敲除

随着最近使用CRISPR / Cas9技术作为基因组编辑的标准工具，世界各地的实验室都经历了自PCR以来最大的分子生物学进展之一。该方法的主要优点是它的简单性和对任何类别的通用性。特别令人感兴趣的是被广泛研究的革兰氏阴性细菌大肠杆菌，因为它被认为是研究和工业应用的主要力量。研究人员提出了一种使用CRISPR/Cas9系统与λRed机器相结合的简单，可靠和有效的方案，用于在大肠杆菌中进行基因敲除。在我们的程序中，至关重要的是使用双链供体DNA和一种固化策略来去除编码RNA的引导质粒，该质粒允许仅在两个工作日内引发新的突变。我们的协议允许具有高诱变效率的多个逐步敲除菌株适用于高通量方法。

全基因组多功能CRISPR系统用于高通量基因型-表型作图

由于我们对细胞网络的了解有限，因此基因组规模的工程设计是了解基因组功能必不可少的工具。不幸的是，大多数现有的全基因组和基因型-的作图方法仅限于基因组改变的单一模式，即过度表达，抑制或缺失。研究人员报告了一种通用的全基因组CRISPR（MAGIC）系统，该系统可将所需基因在整个基因组中的表达水平精确控制在所需水平。据我们所知，通过将三功能CRISPR系统与由阵列合成的寡核苷酸文库结合，MAGIC被用于创建酵母中最全面和多样性的基因组文库之一。 MAGIC的能力通过鉴定以前未表征的复杂表型遗传决定子来证明，尤其是当扰动到不同表达水平时具有协同相互作用的决定子。 MAGIC代表了强大的合成生物学工具，可用于研究基本生物学问题并设计用于生物技术应用的复杂表型。

Ubigene已开发出CRISPR-B™以优化微生物基因编辑载体和工艺。效率和准确性远高于传统方法。 CRISPR-B™可用于细菌和真菌的基因编辑。

Reference

Endo M, Mikami M, Toki S. Multigene knockout utilizing off-target mutations of the CRISPR/Cas9 system in rice. Plant Cell Physiol. 2015;56(1):41-47. doi:10.1093/pcp/pcu154

König, Enrico & Zerbini, Francesca & Zanella, Ilaria & Fraccascia, Davide & Grandi, Guido. (2018). Multiple Stepwise Gene Knockout Using CRISPR/Cas9 in Escherichia coli. BIO-PROTOCOL. 7. 10.21769/BioProtoc.2688.

Jiazhang Lian, Carl Schultz, Mingfeng Cao, Mohammad HamediRad,Huimin Zhao.Multi-functional genome-wide CRISPR system for high throughput genotype–phenotype mapping.Nature Communications .2019.

基因敲除切割效率不仅可以让人具有生成蛋白基化谱和建立调控记录的能力，而且具有多种优势，是一种特别有吸引力的重组蛋白表达系统。首先，它在谷氨酸上羧基化，在酪氨酸上硫酸化。第二，操作简单，通过瞬时基因表达可以快速产生重组蛋白。第三，可用于稳定的重组蛋白生产。一些研究人员利用基因细胞敲除切割效率系统产生基因编辑细胞系，对GLUL基因组位点进行靶向测序，产生了EPO的稳转细胞系，并发现重组促红细胞生成素在人体内稳定表达的机制。