基因敲除里氏木霉

木质纤维素生物质主要由纤维素，半纤维素和木质素组成，是地球上最丰富，可再生的能源。木质纤维素生物质的降解和自然界中碳循环的持续主要通过微生物作用来维持，包括不同的真菌物种，如木霉，曲霉和青霉菌。微生物在自然界中起着重要作用。这些生物产生的降解生物质的酶也可用于食品，饲料，造纸和纺织工业等各个领域。里氏木霉（Trichoderma reesei）是一种真菌，是纤维素酶和半纤维素酶的知名高效生产商，因此被酶工业广泛用于生产其自身的内源酶以及生产异质蛋白。两年来，许多研究表明，CRISPR/Cas9系统是一种强大的基因组编辑方法，基因敲除可促进多种生物体中基因组的遗传改变。到目前为止，还没有关于CRISPR/Cas9系统或其他系统的报道。

尽管该技术已成功应用于酵母中，但丝状真菌，甚至是模型生物Neurospora crassa中的基因组编辑方法也是如此。

里氏木霉（Teelemorph Hypocrea jecorina）是一种嗜温软腐子囊真菌，在工业上被广泛用作纤维素酶和半纤维素酶的来源，用于水解植物细胞壁多糖。来自农作物残余物，草，木材和城市固体废物的木质纤维素生物质代表了丰富的可再生资源，作为未来的生物燃料来源，这一资源变得越来越重要。微生物是地球上对环境无害的肝脏。尽管用纤维素乙醇代替汽油可以显着减少大气中的温室气体并减少全球变暖，但将生物质多糖水解为可发酵糖的高成本仍然是必须有效克服的主要障碍，才能使纤维素乙醇有效地商业化。由于纤维素酶和半纤维素酶的成本大大影响了生物乙醇的价格，因此需要这些酶的廉价得多的来源。因此，基因工程技术，基因敲除方案和DNA介导的转化系统改善了产工业酶的里氏木霉菌株。

使用CRISPR/Cas9系统在里氏木霉中进行有效的基因组编辑

 研究人员通过特异性密码子优化和体外RNA转录证明了在丝状真菌里氏木霉中建立CRISPR/Cas9系统。结果表明，通过诱导Cas9表达，CRISPR/Cas9系统是可控的和有条件的。该系统通过有效的同源重组，甚至使用短的同源臂，在靶基因中产生了位点特异性突变。该系统还提供了同时靶向多个基因的适用且有希望的方法。我们的结果表明，CRISPR/Cas9系统是里氏木霉和其他丝状真菌物种最有力的基因组操纵工具，这可能会加速这些丝状真菌的功能基因组学和菌株改良研究。

使用体外组装的Cas9/gRNA复合体在里氏木霉中快速破坏基因

在这项研究中，研究人员使用CRISPR / Cas9在里氏木霉菌中测试了两种基因破坏方法。细胞内表达的Cas9导致里氏木霉QM9414出现意外脱靶基因破坏，有利于在目标ura5下游70和100 bp处插入9或12 bp。因此，通过在体外组装Cas9和gRNA，然后将核糖核蛋白复合物与含有pyr4标记基因的质粒转化为里氏木霉TU-6，建立了另一种方法。当使用靶向cbh1的gRNA时，发现27个转化子中有8个失去表达CBH1的能力，这表明通过基因组编辑成功破坏了cbh1。将包含共转化质粒，染色体基因或这些核苷酸混合物的大DNA片段插入到破坏的cbh1基因座中.Cas9 / gRNA复合物直接转化入细胞是破坏里氏木霉基因的快速方法并可能在菌株改良和功能基因组学研究中得到广泛应用。

铜控制的RNA干扰系统，用于里氏木霉中靶基因的可逆沉默

研究人员将铜响应性tcu1启动子整合到RNAi介导的沉默系统中，以开发一种可控制的RNAi介导的沉默系统，即一种里氏木霉。作为概念的证明，当各自的RNAi片段被敲除时，在无铜的情况下，成功地敲除了原养型pyr4基因，由Avicel诱导的高表达cel7a和xyr1基因以及敲除被证明难以治疗的fab1基因表达。

基因敲除切割效率不仅可以让人具有生成蛋白基化谱和建立调控记录的能力，而且具有多种优势，是一种特别有吸引力的重组蛋白表达系统。首先，它在谷氨酸上羧基化，在酪氨酸上硫酸化。第二，操作简单，通过瞬时基因表达可以快速产生重组蛋白。第三，可用于稳定的重组蛋白生产。一些研究人员利用基因细胞敲除切割效率系统产生基因编辑细胞系，对GLUL基因组位点进行靶向测序，产生了EPO的稳转细胞系，并发现重组促红细胞生成素在人体内稳定表达的机制。

源井生物根据客户需求，结合靶基因的情况进行基因稳转敲除方案设计

方案1：小片段基因敲除方案，gRNA设在外显子2两端的内含子中，敲除外显子编码碱基数为非3倍数，敲除后可造成移码。

方案2：移码基因敲除方案，gRNA设在外显子上，缺失的碱基数为非3倍数，敲除后可发生移码突变。

方案3：大片段基因敲除方案，将整个基因的编码序列敲除，达到大片段敲除的效果。