基因敲除构巢曲霉

构巢曲霉（Aspergillus nidulans），也被称为构巢曲霉（Emericella nidulans），是遗传学和细胞生物学中重要的真菌系统之一。它一直是研究真核细胞生物学的重要研究对象，也是当下科研界最看重的一方面，这些包括重组，DNA修复，突变，细胞周期控制，微管蛋白，染色质，慢病毒包装，核动力学，致病性，代谢和实验进化。 

真菌在降解生态系统中的生物量方面起着重要作用，因为它们会降解所有类型的有机物。因此，它们是与工业有关的酶有主要来源，例如淀粉酶，纤维素酶，脂肪酶，果胶酶和蛋白酶。完全测序的真菌基因组的数量正在迅速增加。由于大多数丝状真菌的遗传工具开发欠佳，因此目前很难使用基因工程来了解这些真菌的生物学特性并在工业中充分利用它们。因此，为了开发一种可用于遗传操纵非模型丝状真菌的通用方法，科学家们开发了一种适用于丝状真菌的基于CRISPR-Cas9的系统。CRISPR技术通过提高可进行实验的速度和复杂性，彻底改变了真菌基因工程。另外，该系统的效率通常允许将基因工程引入非模型物种。紫花苜蓿（Emericella nidulans）作为工业化学品和酶的来源已有很长的生产历史，并且是用于研究遗传调控，发育生物学，信号转导和次级代谢的发育模型系统。因此，基因敲除，基因敲入或点突变将成为研究构巢曲霉的新方法。

CRISPR在构巢曲霉中高效无标记基因靶向中的应用

特定Cas9/sgRNA介导的DNA双链断裂（DSB）的存活取决于向NHEJ DNA修复途径中添加非同源末端。我们利用这一观察结果开发了TAPE工具，以评估构巢曲霉原型间隔物的效率。而且，在NHEJ缺陷型菌株中，可以进行有效的无标记基因靶向。确实，该研究表明，甚至单链寡核苷酸也可以有效地用作构巢曲霉和黑曲霉中特定Cas9/sgRNA诱导的DNA DSB的修复模板，表明这种修复类型可能广泛分布于丝状真菌传播中。 重要的是，通过使用单链寡核苷酸进行CRISPR-Cas9介导的基因编辑，可以以接近100％的效率引入特异性点突变和基因缺失（基因敲除）。因此，可以在一个转化实验中非常有效地引入两点突变和单基因插入。

Cpf1可以在Aspergilli中快速有效地执行基因组编辑

CRISPR基因编辑的效率归因于RNA引导的核酸酶形成的特定DNA双链断裂。到目前为止，在丝状真菌中，只有Cas9被用作CRISPR核酸酶。由于用Cas9编辑的基因受到其5'-NGG-3'原间隔子相邻基序（PAM）序列的限制，因此重要的是，引入依赖于其他PAM序列的RNA指导的核酸酶以靶向更大的基因组位点。基因敲除大肠杆菌的Cpf1使用由5'-TTTN-3'组成的PAM序列，因此实现此目标是一个有吸引力的选择。在这项研究中，针对构巢曲霉优化的Lb_cpf1密码子可用于丝状真菌中基于CRISPR的基因编辑。研究人员开发了一种基于载体的设置用于Cpf1介导的CRISPR实验，并表明它可以在构巢曲霉和黑曲霉的不同基因座上高效工作。具体而言，Cpf1可以催化寡核苷酸介导的基因组定向诱变和无标记基因靶向。结果表明，Cpf1可以有效地用于曲霉中的基因编辑，从而扩大了CRISPR技术可靶向的基因组DNA序列的范围。

Nidulans中的高效CRISPR敲除

在构巢曲霉中，可以通过转化过程中的同源重组进行基因靶向，但是正确的基因靶向频率是可变的，通常较低。研究人员确定了人KU70基因的构巢曲霉（nkuA），这对于双链断裂修复中DNA的非同源末端连接至关重要。 nkuA（nkuAΔ）的缺失大大降低了转化DNA片段的非同源整合的频率，从而显着提高了基因靶向性。在构巢曲霉中也已经开发了替代的异源标记，但是在构巢曲霉基因组中的任何时候都没有指导整合。 nkuAΔ和异源选择标记一起形成非常有效的靶向sy的基因。

References:

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3. HU Su-lei, LI Gang, FU Yan-bo, DENG Qin, LIU Cheng. Dock180 knockout inhibits proliferation and promotes apoptosis of rat derived H9C2 cardiomyocytes strain. Basic & Clinical Medicine. 2017, 37(4).

基因敲除切割效率不仅可以让人具有生成蛋白基化谱和建立调控记录的能力，而且具有多种优势，是一种特别有吸引力的重组蛋白表达系统。首先，它在谷氨酸上羧基化，在酪氨酸上硫酸化。第二，操作简单，通过瞬时基因表达可以快速产生重组蛋白。第三，可用于稳定的重组蛋白生产。一些研究人员利用基因细胞敲除切割效率系统产生基因编辑细胞系，对GLUL基因组位点进行靶向测序，产生了EPO的稳转细胞系，并发现重组促红细胞生成素在人体内稳定表达的机制。

源井生物根据客户需求，结合靶基因的情况进行基因稳转敲除方案设计

方案1：小片段基因敲除方案，gRNA设在外显子2两端的内含子中，敲除外显子编码碱基数为非3倍数，敲除后可造成移码。

方案2：移码基因敲除方案，gRNA设在外显子上，缺失的碱基数为非3倍数，敲除后可发生移码突变。

方案3：大片段基因敲除方案，将整个基因的编码序列敲除，达到大片段敲除的效果。