基因敲除烟曲霉

介绍：

烟曲霉是曲霉属中的一种真菌，并且是引起免疫缺陷患者疾病的最常见曲霉之一。可以在整个环境中找到它，包括土壤，植物物质和家庭灰尘中。人和动物不断吸入这种真菌的分生孢子。通常，先天性免疫机制会在具有免疫能力的宿主中消除分生孢子，而曲霉菌和过敏性支气管肺曲菌病则是罕见的临床症状。因此，多年来，烟曲霉被认为是一种弱病原体。如今，烟曲霉因其生存的环境和人类生活中起着重要作用而现在在研究中变得越来越流行。此外，CRISPR/Cas9是一种新型的基因组编辑系统，已在烟曲霉中成功建立。科学家已经为烟曲霉产生了一个CRISPR系统，以通过基因敲除，基因敲入，点突变等研究其功能。

烟曲霉是曲霉病的最常见原因之一。第一个是过敏性支气管肺曲霉病，它是对曲霉孢子的过敏反应。这种反应会导致呼吸道和肺部受损。通常在患有哮喘和囊性纤维化等疾病的人中发现。第二种是慢性肺曲霉病，它可能发生在患有慢性肺部疾病的人中，导致在肺中形成称为空洞的空气空间。第三个是侵袭性曲霉病，它是最严重的曲霉病形式，如果不治疗可能致命。当曲霉菌感染开始于肺部并扩散到人体的其他部位，例如皮肤，大脑或肾脏时，就会发生这种情况。侵袭性曲霉病仅在免疫系统严重弱化的人中发生。

烟曲霉靶向基因破坏的CRISPR/Cas9系统的开发

为了测试CRISPR/Cas9系统在烟曲霉中靶向基因破坏的可行性。作为原理的证明，研究人员首先证明了CRISPR/Cas9确实可以用于烟曲霉聚酮化合物合酶基因（pksP）的高效靶向（25％至53％），这一点已通过无色（白蛋白）的产生得以证明。具有预期的基因组改变的突变体。研究人员进一步证明，Cas9核酸酶本身的组成型表达对烟曲霉的生长或毒力无害，因此使CRISPR系统与发病机理研究兼容。综上所述，这些数据表明，CRISPR可用于烟曲霉的功能丧失研究，并有可能增强这一重要病原体的遗传工具箱。

使用CRISPR进行烟曲霉的基因操作

该技术的当前状态严重依赖于基于DNA的表达盒，将Cas9和引导RNA（gRNA）传递至细胞。因此，技术的力量仅限于为表达Cas9和gRNA而设计的菌株。为了克服这些限制，研究人员开发了一种简单且通用的CRISPR-Cas9系统用于基因编辑的删除，该系统可在烟曲霉的不同遗传背景下工作。该系统采用双重Cas9核糖核蛋白（RNP）的体外组装来靶向基因删除。此外，CRISPR-Cas9系统利用35至50 bp的侧翼区域介导Cas9双链断裂（DSB）处的同源重组。在临床分离株DI15-102中获得了相似的删除效率。数据表明，体外组装的Cas9 RNP与微同源修复模板是一种用于烟曲霉基因操纵的有效且通用的系统。在这项研究中，要解决烟曲霉的毒力和抗真菌药物耐药性的多因素性质，需要对多种基因进行机械询问，有时跨多个遗传背景。经典的真菌基因替换系统可能很费力且费时，并且在野生型分离株中，同源重组率低。在这项研究中，用于基因操作的简单通用CRISPR-Cas9系统在烟曲霉的不同遗传背景下产生了有效的基因靶向。

基因敲除切割效率不仅可以让人具有生成蛋白基化谱和建立调控记录的能力，而且具有多种优势，是一种特别有吸引力的重组蛋白表达系统。首先，它在谷氨酸上羧基化，在酪氨酸上硫酸化。第二，操作简单，通过瞬时基因表达可以快速产生重组蛋白。第三，可用于稳定的重组蛋白生产。一些研究人员利用基因细胞敲除切割效率系统产生基因编辑细胞系，对GLUL基因组位点进行靶向测序，产生了EPO的稳转细胞系，并发现重组促红细胞生成素在人体内稳定表达的机制。

源井生物根据客户需求，结合靶基因的情况进行基因稳转敲除方案设计。

方案1：小片段基因敲除方案，gRNA设在外显子2两端的内含子中，敲除外显子编码碱基数为非3倍数，敲除后可造成移码。

方案2：移码基因敲除方案，gRNA设在外显子上，缺失的碱基数为非3倍数，敲除后可发生移码突变。

方案3：大片段基因敲除方案，将整个基因的编码序列敲除，达到大片段敲除的效果。