基因敲除U251细胞系

定义：

U251细胞系是通过外植技术从恶性胶质母细胞肿瘤中衍生而来的，U251细胞系通常用作胶质母细胞瘤研究的实验模型。 U-251 MG细胞系人类已用于研究Pax6（配对盒蛋白）相关的Dkk3（Dickkopf 3）表达增加的机制，通过CRISPR/Cas9敲除PAX6的U251细胞系是常用的工具分子研究PAX6在减轻胶质母细胞肿瘤进程中的作用。而且，U251细胞系可用于从U-251人胶质母细胞瘤细胞系中提取癌干细胞，这使其在基因编辑领域成为受欢迎的细胞系。此外，它经常用于研究胶质母细胞瘤模型中JARID1B（富含Jumanji AT的交互式区域1B）在神经胶质瘤的发病机理中的作用以及艾力诺弗C联合替莫唑胺的治疗效果。因此U251细胞是用于基因敲除，稳转细胞株等的合适细胞。

应用：

 发现PAX6-敲除的U251细胞系具有增强的增殖和集落形成能力

 转录因子PAX6在包括U251细胞系在内的各种癌细胞系中表达。在间变性星形细胞胶质瘤中，PAX6表达与肿瘤级别成反比，从而导致胶质母细胞瘤（最高级别的星形细胞胶质瘤）中PAX6表达低。 U251细胞系通常用作胶质母细胞瘤研究的实验模型。因此，一些科学家开发了PAX6基因敲除的U251细胞系，作为分子研究工具来研究PAX6在减轻胶质母细胞肿瘤进程中的作用。 CRISPR-Cas9技术用于敲除U251 N胶质母细胞瘤细胞中的PAX6。指导RNA被设计成在相对于转录起始位点（TSS）在+25至+58位之间的PAX6基因5'端附近产生突变。强力霉素诱导的EGFP-PAX6表达载体的病毒转导用于在PAX6基因敲除的U251细胞中重新引入（拯救）PAX6表达。通过分析形态，增殖，集落形成能力以及对氧化应激和化学治疗剂的反应，对敲除的U251细胞进行了严格表征。结果表明，与WT细胞相比，敲除的U251细胞具有增强的增殖和集落形成能力，这与临床观察结果一致，表明PAX6可以起到抑癌作用。对于PAX6敲除的U251细胞，与PAX6对照细胞相比，处于G2/M期的细胞百分比增加，表明PAX6使U251 N细胞保持在细胞周期的G1期。有趣的是，与野生型细胞相比，PAX6敲除的U251细胞对H2O2诱导的氧化应激更具适应性。产生的U251 N PAX6-敲除细胞系可以用作研究PAX6的分子功能和机制的工具，该PAX6作为肿瘤抑制因子，涉及肿瘤的进展和胶质母细胞瘤的治疗。

 AEG-1敲除U251细胞的构建和U251细胞中过表达的AEG-1基因显示出降低的细胞迁移能力

 星形胶质细胞升高基因-1（AEG-1）在多种癌症中均过表达，并且在癌症的发生和发展中起着重要作用。研究人员通过CRISPR/Cas9技术构建了AEG-1基因敲除的U251细胞系，以探索AEG-1对U251细胞转移的影响。第一步是合成针对AEG-1的设计sgRNA，然后将sgRNA克隆到pX459质粒中以获得AEG-1-pX459重组载体。将重组载体转染人脑胶质瘤U251细胞，通过TA克隆测序鉴定sgRNA的活性。然后，用嘌呤霉素筛选转移了重组载体的U251细胞，得到AEG-1敲除的U251细胞系。蛋白质印迹法用于检测基因敲除的效率。最后，通过Transwell和Scratch实验的方法评估了AEG-1敲除细胞系的迁移能力。数据显示成功构建了AEG-1-pX459重组载体，并通过TA克隆测序证实了sgRNA的活性，这意味着AEG-1-敲除U251细胞系已成功建立。蛋白质印迹分析表明，U125细胞的敲除效率高达98％。从Transwell和Scratch实验结果来看，AEG-1基因敲除细胞系的迁移能力明显降低。

击倒CA-NFATc1降低了U251细胞系的侵袭能力

 最近的研究表明，活化T细胞的核因子（NFAT）是在侵袭性癌细胞和组织中高度表达的转录因子，其中之一就是U251细胞系。为了研究NFATc1在U251细胞中的作用，研究人员建立了表达NFATc1（CA-NFATc1）组成型活性形式的U251细胞系。

基因敲除切割效率不仅可以让人具有生成蛋白基化谱和建立调控记录的能力，而且具有多种优势，是一种特别有吸引力的重组蛋白表达系统。首先，它在谷氨酸上羧基化，在酪氨酸上硫酸化。第二，操作简单，通过瞬时基因表达可以快速产生重组蛋白。第三，可用于稳定的重组蛋白生产。一些研究人员利用基因敲除切割效率系统产生基因编辑细胞系，对GLUL基因组位点进行靶向测序，产生EPO的稳转细胞系，并发现重组促红细胞生成素在人体内稳定表达的机制。

源井生物根据客户需求，结合靶基因的情况进行基因稳转敲除方案设计。

方案1：小片段基因敲除方案，gRNA设在外显子2两端的内含子中，敲除外显子编码碱基数为非3倍数，敲除后可造成移码。

方案2：移码基因敲除方案，gRNA设在外显子上，缺失的碱基数为非3倍数，敲除后可发生移码突变。

方案3：大片段基因敲除方案，将整个基因的编码序列敲除，达到大片段敲除的效果。

Reference:

5 Contributions HeLa Cells Have Made to Science. Cell Science from Technology Networks. Retrieved 2020-03-25. Yao Ye-bao, Wang Guang-fei, Dong Qing-cai, Cao Cheng. Construction of stable Cdc25C knockout HeLa cell strains using CRISPR/Cas9 gene-editing system, Military Medical Sciences, 2019,42(1):1-5.Huang Rongfu, Peng Weilin, Lin Jiansheng, Lian Jianfeng, Yang Xiaoyu, Zheng Ming. Construction of stable Cdc25C knockout HeLa cell strains using CRISPR/Cas9 gene-editing system. Military Medical Sciences, 2017,41(5):359-362