基因敲除NCI-H1299细胞系

NCI-H1299细胞系，也称为H1299或CRL-5803，是衍生自淋巴结的人类非小细胞肺癌（NSCLC）细胞系。与其他永生细胞系相似，H1299细胞可以无限分裂。另外，H1299细胞具有TP53基因的纯合部分缺失，因此它们不表达会导致其增殖倾向的抑癌p53蛋白。此外，据报道，这些细胞可以分泌肽激素神经调节素B（NMB），但不能分泌胃泌素释放肽（GRP）。具有这些有趣的特征，NCI-H1299细胞成为涉及基因敲除，基因敲入和点突变的生物学领域的流行细胞系。

肺癌是全世界男性和女性中第二大最普遍，最致命的恶性肿瘤。另一方面，NSCLC约占肺癌的85％，这是全球癌症死亡的主要原因。由于H1299细胞系来源于淋巴结，因此这些细胞已被广泛用于肺癌研究。表征癌细胞中累积的遗传改变对理解肿瘤生物学和指导药物设计都具有重要意义。此外，它可能通过基因定制的癌症相关细胞，如基因敲除的H1299细胞等，使有针对性癌症治疗的患者受益。研究表明，NCI-H1299细胞系是一种稳定的细胞系，具有纯合子敲除的功能。一些人类基因使用CRISPR/Cas9。因此，NCI-H1299 ko细胞系通常用于治疗肺癌。

应用：

紫杉醇降低了Rsf-1基因敲除NCI-H1299的迁移和增殖能力。

紫杉醇是治疗肺癌的经典药物，但很容易引起耐药性。因此，迫切需要克服耐药性的新方法。 Rsf-1在肺癌中高表达，并通过NF-κB途径提高紫杉醇耐受性。许多其他基因也与药物抗性有关，例如影响凋亡和细胞周期的基因。 Chen及其同事使用CRISPR-Cas9技术敲除了肺癌细胞和异种移植小鼠中的Rsf-1，并通过调节NF-κB途径的激活及其下游表达来测试Rsf-1是否影响肺癌对紫杉醇的敏感性。基因。结果表明紫杉醇降低了Rsf-1-基因敲除的NCI-H1299和NCI-H460细胞迁移和增殖的能力，并增加了细胞凋亡。在具有源自Rsf-1-敲除细胞的异种移植肿瘤的小鼠中，紫杉醇的抗肿瘤作用增强。因此，通过CRISPR-Cas9技术靶向Rsf-1也已成为治疗肺癌的方法之一。

敲低PON2基因以研究NCI-H1299细胞系增殖

先前的研究表明，与相应的相邻非肿瘤组织相比，NSCLC患者的癌组织中对氧磷酶2（PON2）（一种具有抗氧化特性的内酯酶/芳基酯酶）的表达明显增强。此外，增加的PON2表达可能有助于NSCLC细胞对经典的抗NSCLC治疗药物产生耐药性。但是，研究人员发现，通过siRNA稳定降低PON2的表达可以减少NSCLC细胞（如NCI-H1299细胞）的增殖。

为了进一步阐明PON2在NSCLC细胞增殖中的作用，在NSCLC细胞系NCI-H1299中应用了两个基因编辑系统TALEN和CRISPR/Cas。结果表明，Cas9表达是由外源性强力霉素以可逆方式诱导的，为研究基因表达的变化如何调控NSCLC细胞增殖提供了一个平台。

基因敲除切割效率不仅可以让人具有生成蛋白基化谱和建立调控记录的能力，而且具有多种优势，是一种特别有吸引力的重组蛋白表达系统。首先，它在谷氨酸上羧基化，在酪氨酸上硫酸化。第二，操作简单，通过瞬时基因表达可以快速产生重组蛋白。第三，可用于稳定的重组蛋白生产。一些研究人员利用基因敲除切割效率系统产生基因编辑细胞系，对GLUL基因组位点进行靶向测序，产生EPO的稳转细胞系，并发现重组促红细胞生成素在人体内稳定表达的机制。

源井生物根据客户需求，结合靶基因的情况进行基因稳转敲除方案设计。

方案1：小片段基因敲除方案，gRNA设在外显子2两端的内含子中，敲除外显子编码碱基数为非3倍数，敲除后可造成移码。

方案2：移码基因敲除方案，gRNA设在外显子上，缺失的碱基数为非3倍数，敲除后可发生移码突变。

方案3：大片段基因敲除方案，将整个基因的编码序列敲除，达到大片段敲除的效果。

Reference:

Fan L, Kadura I, Krebs LE, Hatfield CC, Shaw MM, Frye CC, Improving the efficiency of CHO cell line generation using glutamine synthetase gene knockout cells.Aga, M., Yamano, N., Kumamoto, T. et al. Construction of a gene knockout CHO cell line using a simple gene targeting method. BMC Proc 9, P2 (2015). Noh, S.M., Shin, S. & Lee, G.M. Comprehensive characterization of glutamine synthetase-mediated selection for the establishment of recombinant CHO cells producing monoclonal antibodies. Sci Rep 8, 5361 (2018).