基因敲除MDA-MB-231细胞系

MDA-MB-231细胞系是从一名51岁的白人女性转移性乳腺癌的胸腔积液建立的人乳腺细胞系。该上皮细胞系是医学研究实验室中使用最广泛的乳腺癌细胞系之一，特别是涉及CRISPR/Cas9基因敲除那些。

由于缺乏ER和PR表达以及HER2扩增，该细胞系最初被归类为“基础”乳腺癌细胞系。然而，由于它表现出claudin-3和claudinin-4的下调，Ki-67增殖标记物的低表达，与上皮-间质转化有关的标记物的富集，因此现在被认为属于claudin-低分子亚型。以及与乳腺癌干细胞（CSC）相关的特征的表达，例如CD44 + CD24- /低表型。这就是为什么许多研究一直专注于基因编辑MDA-MB-231细胞系的原因。

应用：

1. CRISPR / Cas9诱变使靶向MDA-MB-231细胞的推定癌症依赖性无效。

癌细胞需要表达某些基因的表达，这些基因编码肿瘤生长所必需的蛋白质。沉默这些基因的表达或阻断蛋白质的活性可以触发细胞死亡和持久的肿瘤消退。因此，识别癌症依赖性是临床前癌症研究的关键目标。 MELK被认为是多种癌症类型的癌症依赖性和推定药物靶标，其中之一是MDA-MB-231细胞系。 MELK在乳腺癌细胞中过表达，与患者的不良习惯有关。此外媒据报道，使用RNAi敲低MDA-MB-231细胞中的MELK可阻止癌细胞增殖并触发细胞周期停滞的可能。

研究人员设计了针对MELK的七个指导RNA（gRNA），并将每个指导RNA克隆到一个表达GFP的载体中，并将该指南转导到了三个表达Cas9细胞系中：三阴性乳腺癌细胞系MDA-MB-231,据报道MELK表达对过表达的MDA-MB-231细胞中MELK蛋白水平的蛋白质印迹分析证实，CRISPR系统可有效消除MELK表达。

2.β1整合素对MDA-MB-231乳腺癌细胞增殖和细胞信号传导的不同影响

为了探索β1整合素的功能意义，研究人员通过基于CRISPR/Cas9的方法建立了β1-KOMDA-MB-231细胞。进行蛋白质的印迹和FACS分析以确认MDA-MB-231细胞系中β1的有效敲除。令人惊讶地，β1的表达对细胞增殖表现出相反的作用。这些效应取决于细胞密度，当在稀疏条件下培养细胞时，它们显示出细胞增殖的上调，而在稠密条件下，则表明细胞生长的下调。与野生型细胞相比，KO MDA-MB-231细胞中ERK的磷酸化水平在稀疏培养条件下始终被抑制，而在致密培养条件下始终被上调。 KO MDA-MB-231细胞中EGFR的磷酸化水平增加。相比之下，MDA-MB-231 KO细胞中AKT的磷酸化水平降低。在MDA-MB-231敲除细胞中，集落和肿瘤形成的能力均被显着抑制，这表明β1在肿瘤发生的细胞存活信号转导中起重要作用。在Res细胞中拯救了KO细胞中的这些异常表型。综上所述，这些结果清楚地表明了β1在癌细胞中的独特作用：抑制细胞生长和促进细胞存活，这可能有所启发。

3.敲低BCL2L12导致MDA-MB-231乳腺癌细胞中的顺铂耐药

发现基因BCL2L12在正常乳腺组织中高表达，并且与乳腺癌患者的良好预示后。相关的研究人员在新闻中报道，MDA-MB-231乳腺癌细胞中，顺铂处理后，BCL2L12的mRNA水平及其转录变异体BCL2L12A可能被上调。 BCL2L12和BCL2L12A的组合大大抑制了顺铂诱导的细胞凋亡。相反，每种蛋白质的异位表达促进顺铂诱导的细胞凋亡。这些结果表明，BCL2L12和BCL2L12A的表达降低或缺失可能有助于乳腺癌患者的顺铂耐药性。此外，我们发现顺铂诱导的β-catenin的下调在BCL2L12-和BCL2L12A敲除的MDA-MB-231细胞中被部分抑制，这表明这两种蛋白的敲低可能稳定顺铂诱导的细胞凋亡中的β-catenin。简而言之，我们提出BCL2L12和BCL2L12A可能在顺铂诱导的MDA-MB-231乳腺癌细胞凋亡中起重要作用。

基因敲除切割效率不仅可以让人具有生成蛋白基化谱和建立调控记录的能力，而且具有多种优势，是一种特别有吸引力的重组蛋白表达系统。首先，它在谷氨酸上羧基化，在酪氨酸上硫酸化。第二，操作简单，通过瞬时基因表达可以快速产生重组蛋白。第三，可用于稳定的重组蛋白生产。一些研究人员利用基因敲除切割效率系统产生基因编辑细胞系，对GLUL基因组位点进行靶向测序，产生EPO的稳转细胞系，并发现重组促红细胞生成素在人体内稳定表达的机制。

源井生物根据客户需求，结合靶基因的情况进行基因稳转敲除方案设计。

方案1：小片段基因敲除方案，gRNA设在外显子2两端的内含子中，敲除外显子编码碱基数为非3倍数，敲除后可造成移码。

方案2：移码基因敲除方案，gRNA设在外显子上，缺失的碱基数为非3倍数，敲除后可发生移码突变。

方案3：大片段基因敲除方案，将整个基因的编码序列敲除，达到大片段敲除的效果。

Reference:

 5 Contributions HeLa Cells Have Made to Science. Cell Science from Technology Networks. Retrieved 2020-03-25.

Yao Ye-bao, Wang Guang-fei, Dong Qing-cai, Cao Cheng. Construction of stable Cdc25C knockout HeLa cell strains using CRISPR/Cas9 gene-editing system, Military Medical Sciences, 2019,42(1):1-5.

Huang Rongfu, Peng Weilin, Lin Jiansheng, Lian Jianfeng, Yang Xiaoyu, Zheng Ming. Construction of stable Cdc25C knockout HeLa cell strains using CRISPR/Cas9 gene-editing system. Military Medical Sciences, 2017,41(5):359-362