基因敲除AGS细胞系

 定义：

 AGS细胞系来自一名54岁的白人女性患者的胃组织肿瘤碎片，该患者未接受过任何治疗。该细胞系与胃腺癌疾病密切相关。迄今为止，已经开发了使用不同细胞系的胃癌异种移植物的几种模型。 AGS是胃癌异种移植模型中最常见的细胞系之一。但是，有关此模型的特征的信息有限。因此研究人员通常应用CRISPR/Cas9技术来创建基因敲除或基因敲入AGS细胞系。

AGS敲除细胞系克隆自已用编码载体转染的AGS细胞系，然后进行稳定的细胞选择。该细胞系可以稳定表达CRISPR Cas9核酸酶，GFP和潮霉素抗性基因。结合单独转染的sgRNA，AGS-Cas9 KO细胞系可用于有效产生靶向的基因组修饰，包括基因敲除，基因敲入，基因诱变，基因标记等。它还是sgRNA的理想细胞系模型。单独或在池中进行验证。因此，在涉及胃癌和疾病的研究中，AGS基因敲除细胞系是一种流行的细胞模型。

应用：

使用CRISPR/Cas9基因组编辑系统敲除AGS细胞中的PDEF以研究胃癌

胃癌是全球最常见的恶性肿瘤之一，在中国恶性肿瘤中发病率和死亡率第二高。前列腺衍生的Ets因子（PDEF）是Ets转录因子家族的成员。尽管PDEF在肿瘤发生中起重要作用，但其在胃癌中的生物学功能仍不清楚。研究人员研究了PDEF在胃癌细胞AGS和正常胃上皮细胞GES中的表达。 CRISPR/Cas9基因组编辑系统用于敲除AGS细胞中的PDEF，作为胃癌的模型。进行评估，然后他们使用CCK-8，流式细胞仪，刮擦伤口和Transwell分析法分别评估PDEF敲除AGS细胞的细胞增殖，凋亡，迁移和侵袭。结果表明，PDEF基因的敲除显着抑制了AGS GC细胞的迁移，这暗示PDEF在AGS细胞的增殖，迁移和侵袭中起着重要作用，并可能成为胃癌的新治疗靶点。在Western blot分析的灵敏度范围内，用重组质粒pX459-sgRNA1转染的AGS细胞中的PDEF蛋白根本不表达。降低了PDEF的表达，大大降低了ABS CRISPR细胞的迁移能力，侵袭性和增殖能力。

CRISPR/Cas9介导的LMX1A敲除促进AGS细胞存活和增殖

LIM同源盒转录因子1，α（LMX1A）在人胃癌（GC）中被下调，起着抑癌作用。通过对LMX1A mRNA 3′-非翻译区（3′-UTR）的测序分析，表明microRNA-9（miR-9）可能靶向人LMX1A。在已建立基因编辑的AGS细胞和原代人GC细胞中，慢病毒构建体在异位表达miR-9会降低LMX1A 3'-UTR活性，从而导致LMX1A mRNA和蛋白质下调。功能分析表明，miR-9的过表达增强了GC细胞的存活和增殖。相反，antagomir-9慢病毒对miR-9的抑制作用会增加LMX1A 3'-UTR活性，从而上调LMX1A mRNA和蛋白表达，从而导致GC细胞凋亡。 CRISPR/Cas9介导的LMX1A敲除促进了AGS细胞的存活和增殖。重要的是，miR-9和antagomiR-9在LMX1A敲除AGS细胞的功能上无效。因此，敲除AGS细胞系有助于研究胃癌的影响因素。

基因敲除切割效率不仅可以让人具有生成蛋白基化谱和建立调控记录的能力，而且具有多种优势，是一种特别有吸引力的重组蛋白表达系统。首先，它在谷氨酸上羧基化，在酪氨酸上硫酸化。第二，操作简单，通过瞬时基因表达可以快速产生重组蛋白。第三，可用于稳定的重组蛋白生产。一些研究人员利用基因敲除切割效率系统产生基因编辑细胞系，对GLUL基因组位点进行靶向测序，产生EPO的稳转细胞系，并发现重组促红细胞生成素在人体内稳定表达的机制。

源井生物根据客户需求，结合靶基因的情况进行基因稳转敲除方案设计。

方案1：小片段基因敲除方案，gRNA设在外显子2两端的内含子中，敲除外显子编码碱基数为非3倍数，敲除后可造成移码。

方案2：移码基因敲除方案，gRNA设在外显子上，缺失的碱基数为非3倍数，敲除后可发生移码突变。

方案3：大片段基因敲除方案，将整个基因的编码序列敲除，达到大片段敲除的效果。

Reference:

 5 Contributions HeLa Cells Have Made to Science. Cell Science from Technology Networks. Retrieved 2020-03-25.Yao Ye-bao, Wang Guang-fei, Dong Qing-cai, Cao Cheng. Construction of stable Cdc25C knockout HeLa cell strains using CRISPR/Cas9 gene-editing system, Military Medical Sciences, 2019,42(1):1-5.Huang Rongfu, Peng Weilin, Lin Jiansheng, Lian Jianfeng, Yang Xiaoyu, Zheng Ming. Construction of stable Cdc25C knockout HeLa cell strains using CRISPR/Cas9 gene-editing system. Military Medical Sciences, 2017,41(5):359-362