基因敲除H9C2细胞系

胚胎大鼠心肌细胞的H9C2系是Kimes和Brandt（1976）从胚胎BD1X大鼠心脏组织衍生而来的原始克隆细胞系的亚克隆系。该细胞系显示出骨骼肌的许多特性，其参数在抗癌药的临床前测试，确定其心脏毒性，安全性以及进入后续临床测试阶段的可能性时特别有用。因此，H9C2细胞系广泛用于许多体外研究中，其中一些涉及CRISPR技术来介导H9C2细胞的特性。

H9C2细胞保留了一些信号转导途径的组成部分，这些成分对于它们分化为成熟的心肌细胞至关重要。该细胞系特别用于新的主要是抗癌药物（例如阿霉素）的心脏毒性分析，心肌细胞损伤机理的研究以及所研究化合物对心肌细胞凋亡和坏死的毒性作用的评估。胚胎H9C2心肌细胞在体外条件下增殖良好，可以相对轻松地培养，适合用作CRISPR基因敲除或过表达模型，用于心脏肥大的体外研究，并支持目前与人类心肌细胞系一起用于前瞻性分子研究的工作心脏发育和疾病。

1. C3G基因敲除对H9C2心肌细胞增殖和凋亡的影响

先前的研究发现，在大鼠梗塞周围非梗塞区域的心肌中，C3G表达显着增加。过表达的C3G可促进心肌细胞存活并抑制细胞毒性，而降低C3G则可抑制心肌细胞存活并增加心肌细胞凋亡。使用CRISPR/Cas9系统内置的敲除C3G重组慢病毒感染H9C2心肌细胞，以研究C3G敲除对H9C2心肌细胞增殖的推测作用和机制。用上述慢病毒分别感染H9C2心肌细胞，以研究C3G（Crk SH3域结合鸟嘌呤核苷酸交换因子）敲除对H9C2心肌细胞增殖和凋亡的影响及其潜在机制。

2.利用CRISPR-Cas9基因编辑技术敲除H9c2细胞的Tudor-SN基因，抑制细胞周期阻滞和增殖

CRISPR-Cas9基因编辑技术被用于敲除大鼠心肌H9c2细胞的Tudor-SN（Tudor葡萄球菌核酸酶）基因。研究人员观察到它对H9c2细胞周期和增殖的影响。选择PX462质粒作为载体，使用软件设计可以特异性识别H9c2细胞中Tudor-SN基因第二外显子的上，下游sgRNA（单导RNA）。随后，将这对质粒共转化为H9c2细胞，然后选择阳性单克隆细胞进行培养。用蛋白质印迹法鉴定敲除作用，并使用成功敲除的细胞系通过流式细胞术和CCK-8 实验检测细胞周期和增殖。 Western印迹结果表明，Tudor-SN蛋白在阳性细胞中不表达，并成功敲除了Tudor-SN基因。流式细胞仪结果表明，Tudor-SN基因敲除细胞具有G1期阻滞。 CCK-8实验的结果表明KO细胞的增殖速率减慢。本实验成功构建了H9c2细胞的Tudor-SN基因敲除细胞系，并检测了Tudor-SN基因敲除对细胞周期阻滞和增殖的抑制作用，为Tudor-SN基因在H9c2细胞的调控提供了研究。心肌细胞功能。便利的工具和研究基础。

3. Dock180基因敲除抑制大鼠源性H9C2心肌细胞株的增殖并促进其凋亡

为了研究胞质分裂抑制剂1（Dock180）敲除对大鼠源H9C2心肌细胞增殖和凋亡及其机制的影响，使用CRISPR/Cas9系统设计和构建了靶向大鼠Dock180基因的单个向导RNA（sgRNA）。将包含在sgRNA上方的质粒包装到慢病毒中，并选择其敲除心肌细胞中的Dock180。结果表明，用CRISPR/Cas9 H9C2细胞敲除Dock180可以抑制增殖，并通过p-ERK1/2，Bcl-2和Bax促进H9C2心肌细胞凋亡。

Ubigene Biosciences，我们提供高效和100％保证的CRISPR服务，包括基因敲除/敲入和点突变细胞系。使基因组编辑更加容易是Ubigene的目标。我们的专有技术已成功应用于100多种类型的细胞系中。

CRISPR-U™是Ubigene Bioscience独立开发的专有技术，用于基因编辑细胞系。

基因敲除切割效率不仅可以让人具有生成蛋白基化谱和建立调控记录的能力，而且具有多种优势，是一种特别有吸引力的重组蛋白表达系统。首先，它在谷氨酸上羧基化，在酪氨酸上硫酸化。第二，操作简单，通过瞬时基因表达可以快速产生重组蛋白。第三，可用于稳定的重组蛋白生产。一些研究人员利用基因敲除切割效率系统产生基因编辑细胞系，对GLUL基因组位点进行靶向测序，产生EPO的稳转细胞系，并发现重组促红细胞生成素在人体内稳定表达的机制

源井生物根据客户需求，结合靶基因的情况进行基因稳转敲除方案设计。

方案1：小片段基因敲除方案，gRNA设在外显子2两端的内含子中，敲除外显子编码碱基数为非3倍数，敲除后可造成移码。

方案2：移码基因敲除方案，gRNA设在外显子上，缺失的碱基数为非3倍数，敲除后可发生移码突变。

方案3：大片段基因敲除方案，将整个基因的编码序列敲除，达到大片段敲除的效果。

Reference:

 Fan L, Kadura I, Krebs LE, Hatfield CC, Shaw MM, Frye CC, Improving the efficiency of CHO cell line generation using glutamine synthetase gene knockout cells.Aga, M., Yamano, N., Kumamoto, T. et al. Construction of a gene knockout CHO cell line using a simple gene targeting method. BMC Proc 9, P2 (2015). Noh, S.M., Shin, S. & Lee, G.M. Comprehensive characterization of glutamine synthetase-mediated selection for the establishment of recombinant CHO cells producing monoclonal antibodies. Sci Rep 8, 5361 (2018).