为什么你养RAW264.7细胞总分化？想养得又多又圆，干货来了！

为什么别人养的RAW264.7细胞又多又圆，你养的却总是分化？细胞状态、培养操作和传代方式都可能成为关键影响因素。想要养好RAW264.7细胞，避免分化、维持良好状态，还要顺利开展后续基因编辑？小源这就为你奉上RAW264.7细胞培养与基因编辑Tips，一次解锁关键技巧，少走弯路！

RAW264.7细胞源自Abelson鼠科白血病病毒诱导的小鼠肿瘤，是一株单核巨噬细胞白血病细胞系。该细胞sIg⁻、Ia⁻、Thy-1.2表面抗原阴性，具有胞饮中性红、吞噬乳胶颗粒与酵母聚糖的能力，可抗体依赖性地分解绵羊红血球与肿瘤靶细胞。LPS或PPD处理2天可诱导其分解红血球，是炎症、免疫学和骨代谢研究中应用最广泛的体外模型之一。

一、经白血病病毒转化的小鼠巨噬细胞(RAW 264.7)基本信息

细胞名称：经白血病病毒转化的小鼠巨噬细胞(RAW 264.7)

细胞形态：单核细胞样, 贴壁细胞

细胞培养条件：90%DMEM+10%FBS

气相：空气，95%；二氧化碳，5%

温度：37℃

换液频次：2-3天/次

传代比例：1:2-1:3

细胞生长状态参考：

正常状态：细胞呈圆形、椭圆形或不规则形，透亮饱满，细胞间连接松散；以岛状或片状贴壁生长，片片之间不相连接。（见下图）

异常/分化状态：细胞拉长呈梭形、纺锤形或出现伪足、多角形突起；贴壁变得牢固，吹打不易脱落；胞质内颗粒增多，细胞边界模糊。若大面积出现梭形分化，不建议继续使用。（见下图）

二、RAW264.7细胞复苏流程

1. 准备培养基

取7mL完全培养基于离心管中备用。

2. 细胞解冻

将细胞从干冰里取出，用镊子夹住盖子放入 37℃水浴中快速晃动（注意：水不能没过盖子），使其在1分钟左右完全融化，直至冰块融化至绿豆大小，停止水浴。

3. 细胞离心

将解冻后的细胞悬液转移至离心管中，1100rpm条件下离心4分钟，弃去上清液。

4. 重悬与接种

用完全培养基重悬细胞，接种于合适大小的培养皿或培养瓶中。

5. 细胞培养

将培养皿或培养瓶置于37℃培养箱中培养，24小时后观察细胞状态及贴壁情况。

三、RAW264.7细胞传代步骤（以6cm皿为例）

1. 传代条件

• 当细胞汇合度达到80%时可进行传代；细胞密度过低易生长缓慢并自发极化。
• 传代时在超净台内弃去培养瓶里的培养液（若悬浮细胞较多，需收集上清离心回收）。

2. 细胞吹打/刮取

• 方法一（吹打法）：向培养瓶中加入3mL完全培养基或PBS，轻轻吹打瓶底面数次，将松散贴壁的细胞吹落，切忌剧烈吹打。如果有特别难吹打下来的细胞，这个位置的细胞就不要了，很可能是分化的细胞，还要注意避免产生大量气泡损伤细胞。
• 方法二（刮刀法）：保留3 mL培养液，用无菌细胞刮刀沿同一方向轻柔刮拭细胞（不要来回刮拭），收集刮落的细胞。

3. 细胞悬液离心

• 将收集的细胞悬液转移至15 mL离心管中，1100 rpm室温离心4分钟。
• 离心结束，弃去上清，加入完全培养基轻柔重悬细胞。

4. 传代培养

• 细胞按1:2–1:3比例传代。首次传代或细胞状态一般时建议1:2比例进行。
• 将细胞悬液摇匀后接种至新的培养皿/瓶中，放入培养箱培养。
• 传代次日观察细胞状态，若发现较多漂浮死细胞，应及时换液。

四、RAW264.7细胞冻存步骤

1. 收集细胞

按照细胞传代的过程，用吹打或刮刀法将细胞收集到离心管中（可先加1 mL培养基轻混，吸除状态不佳的漂浮细胞）。

2. 离心

1000 rpm条件下离心4分钟，去掉上清；可用PBS洗涤一次以去除残留血清。

3. 重悬与冻存

用细胞冻存液（推荐：50%DMEM + 40%FBS + 10% DMSO；或无血清细胞冻存液）重悬细胞，调整密度至1×10⁶–1×10⁷个细胞/mL，按每管1 mL分装至冻存管中，标注好名称、代数、日期等信息。

4. 降温与储存

将冻存管置于程序降温盒中，-80℃冰箱中过夜后转入液氮罐内长期保存。

五、RAW264.7细胞培养注意事项

1. 严禁胰酶消化：RAW264.7细胞对胰酶极度敏感，胰酶会刺激细胞分化为梭形、多角形等终末形态，且分化后无法恢复。传代务必使用吹打法或细胞刮刀。
2. 细胞密度是关键：RAW264.7喜欢高密度生长，接种密度过低会导致生长缓慢并加速自发极化。建议保持适当传代密度，避免细胞叠加成层后再传代。
3. 培养器皿选择：推荐使用培养皿而非培养瓶进行培养，培养皿因物理空间和表面张力差异，更易于吹打传代操作，且细胞分化相对较少。
4. 血清质量：该细胞对血清批次较为敏感，劣质血清或血清更换批次时可能引起细胞聚团或贴壁能力改变，建议使用优质胎牛血清并提前试用。
5. 换液与观察：复苏后次日根据状态决定是否换液，频繁换液可能影响细胞生长。正常培养每2–3天换液一次，超过3天不传代细胞容易分化。
6. 操作细节：复苏及传代时所有试剂（培养基、PBS）需提前预热至37℃，减少温度应激；吹打动作务必轻柔，避免机械损伤。
7. 分化细胞处理：培养中存在少量分化细胞属于正常现象。若分化比例较高，可用培养基轻轻吹下（分化细胞贴壁牢固，不易吹下），更换培养皿继续培养。

六、RAW264.7细胞转染时注意事项

1. 细胞状态要求

• 确保细胞状态良好，使用处于对数生长期即汇合度在70–80%的细胞。
• 细胞活率＞85%，可通过台盼蓝进行检测。
• 使用低代次细胞，避免使用已大面积分化的细胞。
• 该细胞贴壁松散，实验过程需要尽可能轻柔操作，避免提前将细胞吹落。

2. 转染试剂与预实验

• 转染试剂使用前需要充分混匀保证其均匀性。
• RAW264.7为免疫细胞系，脂质体转染效率通常较低，建议测试多种转染试剂。
• 若进行稳定株筛选，建议提前进行药筛预实验找到最佳药筛浓度。

3. 电转法（推荐）

• RAW264.7细胞较适合电穿孔转染，效率通常优于化学转染。
• 控制细胞量，电转后根据细胞量接种至合适的培养板里，保证细胞密度。
• 用PBS洗涤细胞1–2次，彻底去除残留血清，避免离子干扰电穿孔。
• 进行预实验对电转参数进行优化。
• 保证电转后细胞贴壁率≥50%。
• 控制实验时间，电转全程不宜过长。

4. 慢病毒法

• RAW264.7细胞对慢病毒感染耐受性尚可，但感染效率可能因细胞状态波动。
• 进行预实验找到最合适的MOI。
• 转染前18–24 h铺板，感染病毒前细胞汇合度控制在30–40%之间。
• 感染前可添加助染剂Polybrene提高感染效率。
• 感染后24 h进行换液。
• 感染使用的病毒液避免反复冻融。
• 若感染效率过低可进行复感染（需确保细胞对病毒耐受性良好）或尝试使用离心法感染。

使用慢病毒法进行基因编辑时的RAW264.7细胞图（左：白场；右：荧光）

七、RAW264.7细胞铺单克隆实验注意事项

细胞状态要求

• 使用对数生长期、未分化的圆形细胞进行铺克隆，铺克隆前细胞汇合度建议控制在70–80%。
• 细胞状态良好时铺克隆细胞活率一般≥90%。
• 收集细胞时轻柔吹打，避免过度机械损伤。

试剂与预实验

• 提前预温所有试剂（包括培养基、PBS）。
• 严禁使用胰酶制备单细胞悬液，建议用吹打法或温和刮刀法制备。
• 建议使用含血清培养基进行极限稀释，维持细胞活性。

铺板策略

• 进行预实验找到合适的铺克隆梯度，避免单克隆占比太低。
• 细胞接种96孔板时需确保细胞分布均匀；外围96孔加入PBS防止蒸发。

稀释方法

• 使用"极限稀释法"进行铺克隆。
• 稀释细胞计数后结果最好落在1*10^6-2*10^6之间。

八、RAW264.7细胞培养常见问题及解决方案

细胞大量分化、呈梭形且贴壁牢固？

表现：细胞失去原有的圆形形态，拉长呈梭形、出现伪足；贴壁变牢，吹打不易脱落；生长速度减慢。

可能原因：

1. 使用了胰酶消化，刺激细胞分化。
2. 细胞密度过低或传代周期过长，导致自发极化。
3. 血清批次不佳或培养环境波动。

解决方法：

1. 立即停用胰酶：改用吹打法或细胞刮刀传代，已分化的细胞在传代时不易被吹下，可直接丢弃。
2. 控制密度与周期：保持1:2–1:3传代，每2–3天传代一次，避免细胞过稀或过密。
3. 优化培养条件：更换优质血清，确保培养箱温度、CO₂稳定；复苏或传代时充分预热培养基。

细胞状态不佳、漂浮死细胞多？

表现：细胞形态皱缩、变暗，大量漂浮；贴壁细胞减少，背景出现颗粒或浑浊。

可能原因：

1. 细菌/真菌/支原体污染。
2. 培养基成分失效（如血清反复冻融）。
3. 吹打过于剧烈或离心转速过高导致机械损伤。
4. 细胞老化或冻存复苏不当。

解决方法：

1. 严格无菌操作：定期检测支原体，发现污染后直接丢弃并彻底清洁培养箱。
2. 使用优质血清，避免反复冻融；配置好的完全培养基建议2周内用完。
3. 吹打时动作轻柔，离心转速控制在1100 rpm左右，时间不超过4分钟。
4. 复苏时快速操作，冻存液融化至绿豆大小时立即停止水浴；优先使用低代次细胞。

细胞生长缓慢怎么办？

表现：细胞增殖速度明显慢于预期，传代周期延长，汇合度上升慢。

可能原因：

1. 接种密度过低，RAW264.7依赖高密度生长信号。
2. 培养基营养不足或pH异常。
3. 细胞发生轻微分化，增殖能力受损。

解决方法：

1. 提高接种密度：复苏或传代时适当提高细胞密度。
2. 规范换液：每2–3天更换新鲜完全培养基；若培养基变黄过快，可增加换液频次。
3. 剔除分化细胞：传代时未分化的圆形细胞易被吹下，贴壁牢固的梭形分化细胞可留在原瓶丢弃，用新鲜圆形细胞继续培养。
4. 保持耐心与合理传代：建议将常规传代周期控制在2–3天，理想的传代比例为1:2至1:3，在细胞汇合度达到80%–90%时及时传代。

【小源提示】RAW264.7细胞倍增时间约为12–30小时，贴壁生长但贴壁松散，培养时严禁使用胰酶消化，否则极易刺激细胞分化。

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