基因敲除细胞HEK293：人源基因研究与疾病细胞模型构建的核心工具

一、HEK293细胞系：人类细胞研究的关键模型

HEK293细胞系源自人胚胎肾细胞，经腺病毒E1A基因转化后获得永生化能力，是一株广泛应用的哺乳动物细胞模型。该细胞系具有典型的上皮细胞形态与功能特征，包括贴壁生长能力强、增殖迅速、转染效率高，以及对外源基因具有良好的表达与加工能力。HEK293细胞的优势在于其人类遗传背景、操作简便且可重复性高，避免了原代细胞分离困难、个体差异大及传代寿命有限的局限，为蛋白质功能研究、信号转导机制及疾病相关基因变异的功能验证提供了高度标准化的人类细胞体外模型。相较于其他常用细胞系如HeLa（人宫颈癌细胞，遗传背景复杂）或COS-7（猴肾成纤维细胞，非人源）， HEK293更接近人类生理环境，尤其适用于研究人类基因突变的功能后果 。

二、HEK293的核心应用：基因功能研究与疾病模型构建

HEK293细胞的高转染效率和易于基因编辑的特性使其成为基因功能研究、蛋白质相互作用分析及疾病相关突变功能验证的核心工具：

基因编辑模型： HEK293对CRISPR/Cas9等基因编辑技术高度兼容，可通过敲除或敲入特定基因构建稳定的细胞模型，用于研究基因功能及其在信号通路中的作用。

蛋白表达与结构解析： HEK293细胞可高效表达外源重组蛋白，为冷冻电镜结构解析提供高质量的蛋白样品。研究者已利用Expi293F细胞表达GGCX-FIX复合物，成功解析了GGCX的2.62 Å高分辨率冷冻电镜结构，揭示了维生素K依赖性羧化的分子机制^[1]。

疾病相关突变功能验证： 因保留完整的人类基因调控网络，HEK293被广泛用于评估临床意义未明变异（VUS）对蛋白质结构、功能及下游信号的影响，为遗传病的分子诊断提供实验依据。

三、HEK293与CRISPR/Cas9技术结合：解析GGCX与POT1基因功能

基于HEK293在基因功能研究中的广泛应用，研究者可借助CRISPR/Cas9基因编辑技术，通过对特定功能基因的敲除或修饰，深入解析其在人类细胞中的调控机制。

1. 编辑GGCX基因：解析维生素K依赖性羧化酶的催化机制

GGCX（γ-谷氨酰羧化酶）是维生素K循环中的核心酶，催化维生素K依赖性蛋白（VKD蛋白）上特定谷氨酸残基的γ-羧化，生成γ-羧基谷氨酸（Gla），该修饰对凝血因子、骨钙素及基质Gla蛋白等的生物学功能至关重要。近期一项研究利用冷冻电镜解析了人源GGCX单独以及与VKD蛋白、维生素K和抑制剂anisindione复合物的结构，揭示了GGCX通过高亲和力前肽结合特异性识别多样化VKD底物的机制，而骨钙素等底物则利用二级外位点增强相互作用^[1]。

基于CRISPR/Cas9构建GGCX敲除HEK293细胞系

为研究GGCX的功能及病理变异，研究者采用基于CRISPR/Cas9技术构建的GGCX基因敲除的HEK293细胞系 （由源井生物提供#YKO-H948 ） 。具体而言，利用桥连PCR以野生型GGCX序列为模板生成GGCX突变体，克隆至pcDNA3.1载体；同时构建GGCX敲除的HEK293细胞系并经测序和Western blotting验证^[1]。该细胞系消除了内源性GGCX的背景干扰，可通过回补野生型或突变型GGCX精确评估变异对羧化酶活性的影响。

该GGCX敲除HEK293细胞模型的应用带来了关键科学发现：

• 解析GGCX二肽锚定与持续性羧化机制。 高分辨率结构揭示GGCX采用保守的二肽锚定机制实现谷氨酸残基的持续性羧化。GGCX发生别构构象变化，协调维生素K和谷氨酸底物的结合，促进催化过程的进行。在GGCX敲除细胞中，通过瞬时转染GGCX野生型或突变体质粒，结合FIX-Flag报告系统，可利用Gla特异性抗体通过ELISA检测羧化效率，从而精准评估不同突变体的功能影响。
• 揭示碳酸氢盐介导的CO₂捕获机制。 研究揭示了GGCX中碳酸氢盐介导的CO₂捕获机制，该机制在细菌和真核物种中均保守存在，提示CO₂利用策略既古老又普遍。这一发现为开发靶向抗凝药物和创新酶促CO₂固定策略奠定了基础。

图1. HEK-293表达纯化GGCX复合物活性中心的催化机制

2. 编辑POT1基因：解析端粒维护蛋白的结构功能与致病变异

POT1（端粒保护蛋白1）是端粒庇护复合物的核心组分，直接结合染色体末端的单链TTAGGG重复序列，在端粒长度调控、染色体末端保护及基因组稳定性维持中发挥关键作用。POT1基因的胚系突变与多种恶性肿瘤风险增加相关，包括慢性淋巴细胞白血病、家族性黑色素瘤、胶质瘤及心脏血管肉瘤等^[2]。

基于CRISPR/Cas9构建POT1敲除HEK293T细胞系

为系统评估POT1错义变异的功能影响，研究者利用到POT1基因敲除的HEK293T细胞系（HEK293T-hPOT1-KO） （由源井生物提供#YKO-H715） 。具体流程如下：首先将pLPC-myc-hPOT1野生型、空载体及突变体质粒分别转染至Platinum-A逆转录病毒包装细胞系，收集逆转录病毒并感染HEK293T-hPOT1-KO细胞，经嘌呤霉素筛选一个月获得稳定表达细胞系^[2]。该细胞系消除了内源POT1的干扰，为精确评估变异对端粒结合、蛋白互作及端粒保护功能的影响提供了标准化平台。

该POT1敲除HEK293T细胞模型的应用带来了重要科学发现：

• 阐明POT1错义变异的分子致病机制。 研究者利用POT1敲除HEK293T细胞，系统评估了来源于新加坡SG10K人群和临床病例的24个POT1错义变异。通过电泳迁移率变动分析发现，D224N、H266Q和S270N变异显著降低了POT1与端粒寡核苷酸的结合亲和力；端粒功能失调诱导灶分析显示，H266Q和P371T变异细胞中DNA损伤灶数量显著升高；免疫共沉淀实验证实，P601L和Q623H变异破坏了POT1-TPP1蛋白相互作用。
• 区分不同POT1变体的功能后果与致病分类。 该细胞模型明确了POT1变异的多样性功能影响：N端OB-fold结构域变异主要影响端粒DNA结合，而C端变异主要破坏TPP1相互作用。基于分子动力学模拟、稳定性预测和功能实验的多层次证据，该研究对D224N、H266Q和P601L提出了“可能致病”的ACMG分类建议，为临床遗传咨询提供了关键的实验依据。

图2. POT1敲除HEK293T细胞模型用于变异功能分类

结语

上述 GGCX 与 POT1 的研究仅是 HEK293 结合 CRISPR/Cas9 技术的代表性案例。这套组合可看作一座 人源基因模块化测试工作台 ： HEK293 提供人源遗传背景，CRISPR-Cas9 作为精密的基因操作工具 ， 敲除内源靶基因以消除背景干扰，再回补野生型或突变基因，建立基因-蛋白-细胞表型之间的关联 。该平台被广泛用于解析人源基因基础功能、鉴定临床意义未明变异的致病性、开展蛋白酶学机制研究以及药物靶点验证。但作为体外通用细胞模型，它如同通用模拟器，无法复刻各类组织特异性生理特征，也缺失体内微环境，相关研究结果仍需体内实验进一步验证。

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参考文献

• Wu K, Wang Z, Yao D, Li S, Wang X, Zhang Y, Cao M, Shen Y, Xing S, Wu J, Lei M, Lan P. Structural insight into bicarbonate-mediated carboxylation by human vitamin K-dependent carboxylase. Nat Commun. 2025 Nov 25;16(1):10480. doi: 10.1038/s41467-025-65488-3. PMID: 41290650; PMCID: PMC12647623.
• Nguyen T, Bora N, Ye J, Chong ST, Sutopo RC, Mu Y, Ngeow J. In silico and in vitro mutational analysis to investigate the structure and pathogenicity of POT1 missense variants. NAR Mol Med. 2025 Mar 8;2(2):ugaf004. doi: 10.1093/narmme/ugaf004. PMID: 41255705; PMCID: PMC12429947.