体内双向CRISPR筛选识别BLBC驱动基因，揭示非整倍体的肿瘤选择机制

期刊： Nature（IF=56.1）

小鼠模型： 免疫健全基因工程小鼠（基底样乳腺癌 BLBC 模型）

筛选工具： CRISPR-KOALA（CRISPR 敲除 sgRNA + CRISPR 激活 dgRNA 双向筛选文库）

筛选策略： 向免疫健全 BLBC 小鼠乳腺导管注射文库慢病毒，靶向 BLBC 高频变异 10 个染色体臂共计 3752 个基因；收集 1478 例小鼠肿瘤提取 gDNA，高通量测序解析 gRNA 丰度，采用 MAGeCK 算法筛选候选肿瘤驱动基因；初筛得到候选基因后，利用体外细胞、移植瘤模型开展后续功能与分子机制验证。

引言

拷贝数变异引发的非整倍体在基底样乳腺癌（BLBC）中十分普遍，但染色体臂内真正的肿瘤驱动基因以及非整倍体促癌机制仍不清楚。本研究构建 CRISPR-KOALA 体内双向筛选平台，筛选出90个BLBC驱动基因； 证实激活/失活这些驱动基因可使肿瘤不再依赖非整倍体 ；并揭示 9p 区 PLGRKT 通过线粒体重塑、增强 ROS 解毒发挥癌基因功能，阐明染色体臂拷贝数变异通过筛选特异性驱动基因推动 BLBC 肿瘤演化。

研究背景

非整倍体在绝大多数实体瘤中普遍存在（尤其是BLBC），但其驱动肿瘤发生的具体分子机制及其肿瘤特异性与高重复性机制尚不明确；这一认知空白直接阻碍了基于非整倍体特征的临床靶向治疗策略的开发以及肿瘤生物学的完善。

研究目的

本研究旨在开发一种体内双向遗传筛选技术（CRISPR-KOALA），系统鉴定BLBC中由非整倍体选择的功能性驱动基因。通过功能补偿实验验证单一关键基因对整条染色体臂促癌效应的替代能力，进而阐明非整倍体驱动肿瘤发生的核心逻辑。同时，结合人类临床样本评估新发现驱动基因的跨物种保守性及其作为治疗靶点的潜在价值。

研究方法

• 1.体内双向遗传筛选技术（CRISPR-KOALA）： 研究团队自主构建了一种并行CRISPR筛选系统。该系统整合了CRISPR敲除（loss-of-function）与CRISPR激活（gain-of-function）两种遗传操作，允许在同一动物模型中同时对靶基因进行正反双向的功能评估。
• 2.靶向基因文库构建： 针对BLBC中10条发生频率最高的臂级CNA染色体区域，设计并构建了覆盖3752个小鼠同源基因的定制化单向导RNA（sgRNA）文库。
• 3.动物模型： 采用Trp53条件性敲除的免疫健全小鼠作为BLBC自发成瘤模型，以保留完整的肿瘤-免疫微环境相互作用。
• 4.多组学与跨物种验证： 对筛选所得候选基因进行转录组测序（RNA-seq），并与人类癌症基因组图谱（TCGA）中BLBC样本的转录组数据进行跨物种比较分析；同时，在人类BLBC细胞系中进行候选基因的功能获得与缺失实验。
• 5.分子机制解析： 采用线粒体呼吸功能测定、细胞内活性氧（ROS）水平定量检测及蛋白质相互作用网络分析等方法，解析候选基因的效应通路。

研究路线

该研究遵循“平台构建→系统性筛选→功能验证→机制解析”的递进式路线：

• 1、研究对象与筛选工具确立： 分析确定BLBC作为研究对象，并建立CRISPR-KOALA系统进行体内敲除和激活双向筛选平台。
• 2、体内正向遗传筛选： 将CRISPR-KOALA文库转导至Trp53缺陷的小鼠乳腺上皮细胞，经原位移植后观察肿瘤发生进程；收集肿瘤组织进行sgRNA深度测序，通过比较敲除组和激活组中sgRNA的丰度变化，鉴定出具有促癌或抑癌功能的候选基因。
• 3、核心驱动基因的独立验证： 在独立的动物模型中，分别对筛选出的候选基因（如Fbxw7, Csnk1a1, Plgrkt）进行单一基因的功能操纵，观察其是否足以在表型上复现整条染色体臂CNA的促癌效应。
• 4、效应基因PLGRKT的机制研究： 针对筛选出的强效致癌基因PLGRKT，利用细胞和分子生物学手段明确其具体的信号传导途径。
• 5、临床相关性分析： 将小鼠模型结果与人类临床样本数据进行比对，评估发现的跨物种保守性。

主要结果

1.功能性驱动基因图谱的绘制

在多种癌症中，BLBC的基因组不稳定性和非整倍体现象尤为突出和规律。它并非随机地出现染色体异常，而是被特定的、高度重复的染色体臂级CNAs所定义。例如BLBC患者常见染色体4、5q、14q、15q和12q的缺失，以及染色体10p、12p、6p和9p的扩增。 针对该CNV区域内的相关基因设计sgRNA/dgRNA进行体内双向筛选 ，共鉴定出90个与BLBC发生相关的功能性驱动基因。其中绝大多数基因在此前未被报道与乳腺癌直接相关。

图1. CRISPR-KOALA体内双向筛选确认BLBC CNAs中肿瘤驱动基因

2.关键驱动基因的功能补偿效应

在人和小鼠BLBC中，存在广泛的CIN及大量复发性非整倍体特征，表明肿瘤发展过程中，还存在其他基因组驱动事件受到选择作用。而单独上调Plgrkt或失活Fbxw7、Csnk1a1等上述实验鉴定的肿瘤驱动基因，足以显著加速肿瘤发生。该结果表明，对单一或少数特定驱动基因的功能操纵，能够在功能上补偿整条染色体臂CNA的促肿瘤效应。作者据此推断，非整倍体的核心作用并非通过全局基因剂量效应直接驱动转化，而是选择性富集了这些关键驱动基因的功能获得或丧失。且存在三个癌症驱动性突变即足以驱动肿瘤发生，而无需依赖非整倍体现象；反之，携带两个或更少突变的肿瘤则倾向于形成非整倍体基因组。这些研究结果表明，不同物种间具有类似的规律性CNAs 形成，从而支持了“特定驱动基因驱动着特定CNAs 选择”的这一结论。

图2. 对BLBC驱动基因的调控绕过了对非整倍体积累的需求

3.PLGRKT致癌机制的新发现

PLGRKT的促癌功能不依赖于其经典的纤溶酶原受体活性。其机制在于通过增强线粒体氧化磷酸化功能并提高活性氧（ROS）的清除效率，从而赋予肿瘤细胞在氧化应激微环境中的生存优势。

图3. PLGRKT通过线粒体重编程驱动肿瘤发生

研究意义与创新点

• 理论框架的更新： 该研究将非整倍体促癌机制的理解从“全局剂量效应”模型，推进至“关键基因选择”模型。即非整倍体 主要贡献在于提供基因组层面的选择背景 ，而非直接贡献所有受累基因的表达改变。
• 技术方法的创新： CRISPR-KOALA平台为在免疫健全微环境中系统性双向解析肿瘤相关基因功能提供了工具平台，可推广应用于其他癌种或基因组不稳定相关的功能基因组学研究。
• 新的治疗靶点与生物标志物： 首次将PLGRKT鉴定为BLBC的功能性致癌基因 ，并明确其ROS调控机制，为BLBC的靶向治疗提供了新的候选分子靶点和潜在的伴随诊断标志物。
• 肿瘤演化理论的实验证据： 为染色体不稳定性在肿瘤克隆演化中的选择性作用提供了直接的体内遗传学证据，有助于理解肿瘤异质性的形成基础。

文章小结

综上所述，该研究借助自主开发的CRISPR-KOALA体内双向遗传筛选技术，首次在基底样乳腺癌中系统性地解构了非整倍体与功能性驱动基因之间的因果关系，实验验证关键驱动基因而非成簇相关基因的突变足以直接驱动肿瘤发生。该发现从根本上更新了对非整倍体致癌机制的理论认知，并将研究焦点从大量伴随性基因组改变重新导向至有限的可干预靶点，为基底样乳腺癌的精准治疗提供了新的干预策略与分子标记物。

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参考文献

Al-Zahrani, K.N., Langille, E.R., Nurtanto, J. et al. Aneuploidy selects for the acquisition of driver genes in breast cancer. Nature (2026). https://doi.org/10.1038/s41586-026-10752-9