绕过体外筛选盲区！体内CRISPR筛选发现实体瘤T细胞编辑新靶点

期刊： Nature（IF=56.1）

细胞模型： T 细胞；多种实体瘤细胞系

筛选工具： Brunello 人全基因组 CRISPR 敲除 sgRNA 文库

筛选策略：构建表达 anti‑CD3 scFv 的 A375^low 肿瘤模型，将文库编辑人 T 细胞回输荷瘤 NSG 小鼠；分别开展肿瘤 T 细胞丰度筛选（肿瘤 vs 输入）、IFN‑γ 效应功能筛选（IFN‑γ 高 TIL vs IFN‑γ 低 TIL）；MAGeCK‑RRA 分析 sgRNA 丰度，筛选调控 T 细胞浸润、耗竭、效应功能的关键基因，开展体内外机制与疗效验证。

前言

CART/TCRT 在血液肿瘤疗效卓越，但实体瘤受肿瘤微环境（TME）多重抑制（浸润受阻、代谢压力、多重抑制信号），疗效差。体外 CRISPR 筛选难以模拟完整肿瘤微环境；既往小鼠体内筛选最大瓶颈是肿瘤内 T 细胞回收数量极低，无法实现全基因组高覆盖筛选。 本研究构建新型体内CRISPR筛选平台，克服 T 细胞回收难题，完成两套全基因组体内 CRISPR 敲除筛选，锁定P2RY8（调控 T 细胞肿瘤浸润）、GNAS（T 细胞多重抑制信号的收敛节点，驱动 T 细胞耗竭）；P2RY8 与 GNAS 双敲除可以协同提升 CART 抗肿瘤效果，为实体瘤 T 细胞工程改造提供全新靶点组合。

研究创新点

1. 技术创新：开发表达 antiCD3 scFv 肿瘤细胞模型，极大提升肿瘤浸润人 T 细胞（TIL）回收数量，少数小鼠即可完成人 T 细胞全基因组体内 CRISPR 敲除筛选；建立两套筛选读数：T 细胞体内丰度、胞内 IFNγ 效应分子表达，同时筛选浸润与效应功能调控基因。
2. 理论创新：发现肿瘤分泌 GGG 配体激活P2RY8Gα13通路，限制人 T 细胞向肿瘤迁移浸润；鉴定GNAS（编码 Gαs）是肿瘤微环境多种 GPCR 抑制信号的收敛中枢，敲除 GNAS 让 T 细胞同时抵抗腺苷、前列腺素 E2、酸性环境、肾上腺素等多重抑制；P2RY8GNAS 双编辑同时解决 “浸润不足”+“肿瘤内耗竭” 两大实体瘤 T 细胞痛点。
3. 转化创新：GNAS 敲除在多种 CART、TCRT、转移瘤、免疫健全小鼠模型中广谱提升抗肿瘤效果，临床前安全性良好；P2RY8 无小鼠同源基因，只能通过人 T 细胞体内筛选发现，凸显人源体系筛选价值。

研究路线

1. 构建 antiCD3 scFv 表达的 A375^low 肿瘤体内筛选平台，验证该模型 TIL 重现病人 T 细胞耗竭表型；
2. 全基因组丰度 CRISPR 敲除筛选，筛选调控肿瘤内 T 细胞留存 / 浸润基因，解析 P2RY8Gα13 信号轴抑制 T 细胞肿瘤浸润机制；
3. 基于 IFNγ 分泌分选，开展全基因组效应功能 CRISPR 敲除筛选，锁定 GNAS；解析 GNAS/Gαs 作为多重抑制 GPCR 下游收敛节点的分子机制；
4. 在 CART、TCRT 多种实体瘤模型，包括转移模型、免疫健全小鼠模型，验证 GNAS 敲除抗肿瘤增益与安全性；
5. 验证 P2RY8、GNAS 双敲除协同抗肿瘤效果，完成平台总结与转化展望。

主要结果

1.anti-CD3 scFv肿瘤模型实现高效T细胞回收并诱导TIL功能障碍

将OKT3来源的anti-CD3 scFv导入A375黑色素瘤细胞，经单细胞克隆筛选获低、中、高三个表达克隆。A375^low克隆每肿瘤可回收约7×10⁶个多克隆人T细胞，较野生型A375（约2×10⁵个）提升逾30倍。表型分析显示，A375^low肿瘤浸润淋巴细胞（TIL）较脾脏T细胞高表达耗竭标志物PD-1、CD39，低表达激活标志物CD154、CD69、CD137，增殖和效应细胞因子产生减少，代谢功能受损，体外杀伤能力减弱。该模型在标准剂量下延缓肿瘤生长、高剂量下清除肿瘤，在T细胞激活与功能障碍压力间取得理想平衡，为全基因组体内CRISPR筛选奠定技术基础。

图1.表达抗CD3单链抗体片段（scFv）的肿瘤模型可实现从肿瘤组织中高效回收人源T细胞，并诱导出肿瘤内T细胞功能障碍的典型特征

2.全基因组体内丰度筛选鉴定GPCR信号通路调控T细胞肿瘤浸润

采用约77,000条sgRNA的Brunello全基因组KO文库，转导两个供体的人原代T细胞，Input端约500×覆盖度。编辑后T细胞输注A375low荷瘤小鼠，9天后回收Input、脾脏和肿瘤测序，均维持>1000×覆盖度且分布均一，无文库瓶颈。MAGeCK分析重新发现ZC3H12A、SOCS1、MAP4K1、TNFAIP3等已知负调控因子。GPCR信号基因在肿瘤富集hit中显著突出，包括P2RY8、GNA13、ARHGEF1、PTGER4、CXCR4和S1PR1，其中P2RY8、GNA13和ARHGEF1构成P2RY8-Gα13信号轴，提示该通路调控T细胞肿瘤浸润。

图2. 通过全基因组体内CRISPR筛选，鉴定出调控实体瘤中人类T细胞数量的GPCR信号通路

3.肿瘤分泌GGG通过P2RY8-Gα13轴抑制T细胞迁移与肿瘤浸润

P2RY8的生理配体为GGG，通过Gα13-ARHGEF1-RHOA轴抑制细胞迁移。配体生物测定显示A375、OE19、AsPC-1和A549四种肿瘤上清均可抑制P2RY8⁺细胞趋化，LC-MS/MS证实肿瘤分泌GGG。Transwell实验显示P2RY8 KO T细胞在肿瘤上清和CXCL12存在时迁移能力显著高于对照。体内竞争实验中，P2RY8 KO与对照T细胞1:1混合输注48小时后，脾脏比例维持，肿瘤中P2RY8 KO细胞在多种体系中均显著富集。P2RY8缺乏小鼠同源基因。P2RY8 KO在慢速生长模型中显示肿瘤控制趋势，但不改善耗竭标志物，提示单纯增强浸润不足以克服TME抑制。

图3.GGG–P2RY8信号轴抑制人类T细胞在实体瘤中的迁移

4.IFN-γ体内筛选鉴定GNAS为多重TME抑制信号的收敛节点

从肿瘤回收T细胞后，按IFN-γ表达分选high/low群体测序比较。GPCR信号介质在IFN-γ^high细胞中显著富集，顶部hit包括GNAS、STUB1和GNA13，其中GNAS和STUB1为体内筛选独有发现。GNAS编码Gαs，可被腺苷、前列腺素、酸敏和β肾上腺素等多种抑制性GPCR共同激活，通过cAMP-PKA轴传导抑制信号。功能验证显示，无抑制配体时GNAS KO与对照无差异；但施加PGE₂、A2A激动剂、酸性pH、多巴酚丁胺等单一或联合抑制时，GNAS KO表现显著保护，四种抑制联合时优势尤为明显。GNAS在体外单刺激筛选中排名第836位，体内跃升至第11位。

图4.基于IFN-γ的全基因组体内 CRISPR 筛选技术揭示了实体瘤中T细胞功能的关键调控因子

5.GNAS KO广谱增强实体瘤CAR-T疗效，P2RY8/GNAS双敲除协同增效

CD19-A375模型中，GNAS KO CAR-T组6只小鼠均持久清除肿瘤，对照仅1只控制。在AsPC-1、MES-SA、OE19等模型及B7H3 CAR-T、NY-ESO-1 TCR-T体系中均显著增效。MES-SA存活小鼠再攻毒仍排斥肿瘤，提示形成免疫记忆。安全性显示GNAS KO T细胞保持抗原依赖性杀伤，无脱靶毒性，细胞因子撤除后正常收缩，小鼠无体重下降。构建P2RY8/GNAS双KO CAR-T，CD19-A549模型中AAVS1对照0/6完全缓解（CR），P2RY8单KO 0/6 CR，GNAS单KO 1/6 CR，双KO达4/6 CR，免疫荧光证实双KO组T细胞浸润最显著，证明双靶点组合协同增效。

图5.GNAS 消融术可增强多种临床前实体瘤模型中T细胞的治疗适应性

研究小结

本研究搭建人原代 T 细胞体内全基因组 CRISPR 敲除筛选平台，利用丰度、IFN‑γ 功能两套筛选读数，得到两个关键靶点。肿瘤分泌 GGG 激活P2RY8‑Gα13通路，阻碍 T 细胞浸润；该人类特有靶点单敲仅提升浸润，难以抵抗肿瘤内部抑制。GNAS(Gαs)是多条 TME 抑制 GPCR 信号的收敛节点，敲除后 T 细胞可抵抗多重抑制，在多种临床前模型中显著提升 CAR‑T/TCR‑T 疗效，安全性可靠。P2RY8+GNAS 双编辑实现协同效应，为实体瘤 T 细胞多基因改造提供新方向。

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