源井生物

基因编辑实战技巧

Gene Editing Practical Tips

CRISPR/Cas9构建稳定敲除细胞系的实用指南—— 从 sgRNA 设计到单克隆验证的系统流程

CRISPR/Cas9 基因编辑技术以其高效、简便和可编程性，已成为研究基因功能、疾病机制及药物靶点验证的核心工具。相比瞬时编辑，稳定敲除细胞系（Stable Knockout Cell Line） 能在多代传代中保持一致的基因缺失状态，确保实验结果的重复性与可靠性，是基础研究与药物开发中不可或缺的模型系统。然而，稳定敲除细胞系的构建是一个多环节、系统性工程，涵盖了从 sgRNA 设计到单克隆筛选的多个关键步骤。小源将系统介绍利用 CRISPR/Cas9 构建稳定敲除细胞系的标准流程，并说明如何借助源井生物（Ubigene）的专业技术平台，实现更高效、更精准的基因编辑结果。

在实验开始前，应全面评估目标基因及细胞特性，确保设计方案科学合理。主要包括以下环节：

• · 基因信息确认：检查目标基因的转录本差异、可变剪接情况和功能结构域（可参考 Ensembl、NCBI 等数据库）。
• · 细胞特性评估：了解细胞的转染效率、生长速率、药物敏感性及是否属于难转染类型（如原代细胞、干细胞、免疫细胞等）。
• · 基因可编辑性评估：参考 DepMap、Gene Essentiality 等公开数据库，或者使用源井生物的Gene Dependency Assessment系统，判断基因是否为必需基因，避免因敲除导致细胞死亡或增殖障碍。
• · 下游验证方法准备：提前规划验证方案，包括蛋白检测（Western Blot）、qPCR、功能实验以及一代测序（Sanger Sequencing）等。

图一：敲除细胞系构建流程

1. sgRNA 与基因型鉴定引物（Genotyping Primer）的设计与合成

• · sgRNA 设计：通过分析目标基因序列，选择合适的靶点。建议优先选择靶向关键功能结构域外显子的 sgRNA，以实现更彻底的基因失活。设计时应综合考虑以下因素
• · On-target 编辑效率评分
• · 潜在脱靶效应（可使用 CRISPOR、Benchling 、红棉CRISPR基因编辑系统等工具）
• · 外显子位置、阅读框影响及 PAM 序列可及性
• · 引物设计：根据 sgRNA 靶点上下游序列设计 PCR 引物，扩增长度建议控制在 250–800 bp 之间，以便后续突变检测（T7E1 断裂实验或 Sanger 测序）。

2. 载体构建

将 sgRNA 序列克隆至含有 Cas9 蛋白及筛选标记（如嘌呤霉素、EGFP）的载体中。源井生物的红棉 gRNA 载体库拥有超过 10,000 种现货载体，采用优化的载体骨架结构，可显著提升 sgRNA 表达与 Cas9 切割效率，特别适用于难转染细胞及多靶点联合编辑研究。 可广泛应用于肿瘤学、神经科学、代谢疾病及细胞治疗等研究领域。

3. 质粒验证

通过测序验证 sgRNA 插入的准确性与序列完整性，确保无突变、插入缺失或方向错误。质粒验证是整个实验的质量控制关键，可有效避免假阴性或非特异编辑结果。

4. 质粒制备与质量检测

制备高纯度、无内毒素质粒，用于细胞转染。检测 A260/A280 比值（应为 1.8–2.0），并使用琼脂糖电泳确认质粒完整性。内毒素会影响转染后的细胞生理状态，低纯度DNA含有各种杂质影响转染效率。

5. 转染前优化

为确保编辑效率，建议进行充分的准备工作：细胞处于对数生长期、无支原体污染、细胞密度适宜（一般为 70–90% 融合度）、根据细胞类型选择最佳转染方式（化学法、电穿孔、病毒转染等）。

6. 细胞转染

将 CRISPR/Cas9-sgRNA 质粒导入细胞。设置适当对照：空载体阴性对照、阳性对照（编辑已知可见表型基因）、通过荧光或抗性筛选监测转染效率。

7. Cell Pool 筛选与鉴定

转染 48–72 小时后收集细胞群体（Cell Pool），提取基因组 DNA 进行突变检测。常用检测方法包括：

• · PCR + Sanger 测序：精确鉴定插入/缺失类型（indel）
• · T7E1 或 Surveyor 断裂实验：评估编辑效率与突变比例。

源井生物采用 PCR + 测序双重检测法评估编辑效率，并通过并行策略筛选最佳敲除效率的细胞群，为后续单克隆筛选节省时间。源井生物拥有Genotype Analysis System可以一键拆解测序结果，并完成分析，可快速获取Cell Pool的敲除效率结果。

图二：源井生物基因型分析系统

8. 单克隆细胞筛选与扩增

通过有限稀释法或流式分选（FACS）将细胞分配至单孔，实现单细胞克隆培养。扩增后提取基因组 DNA，再次进行突变检测，确认敲除类型（Homozygous/bi-allelic KO）。经验证的单克隆应进行功能验证，如蛋白表达丢失或信号通路变化，以确保真正实现基因敲除。

9. 质量检测与冻存

稳定敲除细胞系建立后，应进行以下质量控制步骤

• · 支原体检测：确保无污染
• · STR 鉴定：验证细胞身份一致性
• · 功能验证：检测靶基因表达及相关表型

通过质量检测的敲除细胞系应及时冻存（如使用含 10% DMSO 的 FBS 冻存液），以备后续使用。

构建稳定敲除细胞系过程复杂，对技术经验与细胞特性要求较高。源井生物（Ubigene） 提供从设计到交付的一站式基因敲除解决方案，帮助科研人员高效获得可靠的模型系统。源井生物的核心优势包括：

• · CRISPR-U™ 技术平台：编辑效率提升 10–20 倍，复杂细胞成功率达 90% 以上
• · 红棉CRISPR基因编辑系统： 基于 AI 算法与1000+ 细胞参数数据库，实现自动化设计与风险评估；
• · 8000+ 标准化敲除细胞库：提供即用型细胞模型，满足多领域研究需求；
• · 全流程质控体系：STR 鉴定、支原体检测、功能验证，确保细胞质量稳定可靠。

凭借累计 8000+ 成功项目经验，源井生物为全球科研机构和药企提供高质量敲除细胞系，显著缩短研发周期。

CRISPR/Cas9 构建稳定敲除细胞系是解析基因功能与疾病机制的关键手段。通过科学的 sgRNA 设计、优化的转染策略以及严格的筛选验证，可获得高质量、可重复的敲除模型。若希望在保持实验可控性的同时，提升效率与成功率，源井生物的专业敲除细胞系服务可为科研人员提供高效、可靠、省时的整体解决方案，助力生命科学研究与创新。