腺相关病毒（AAV）包装

IF=16.6|源井包装腺相关病毒助力构建关节炎疾病模型

类风湿性关节炎(RA)是一种病因未明，慢性全身性的免疫性疾病，发病机制尚不清楚，且发病率随着年龄的增长而增加。目前的研究表明，包括年龄、吸烟史、免疫原性和遗传多态性在内的多种因素可能与RA的发病机制有关。代谢性DNA损伤和免疫系统的持续激活是推动细胞衰老的重要生物活动。在衰老过程中，DNA片段在血液中积累和循环，成为循环游离DNA (circulating free DNA,cfDNA)，而cfDNA也被认为是许多疾病的生物标志物。

澳门科技大学埃尔文内尔博士生物物理与创新药物实验室\中药质量研究国家重点实验室及西南医科大学附属医院在Nature Communications联合发表 Age-related self-DNA accumulation may accelerate arthritis in rats and in human rheumatoid arthritis一文，利用源井包装的AAV过表达病毒构建大鼠模型，证实了DNA碎片是炎症介质，TREX1基因在类风湿性关节炎(RA)发病中发挥免疫调节作用^[1]。

在这项研究中，作者假设细胞游离DNA(cfDNA)介导的自身免疫激活和DNA清除酶的功能障碍可能是影响老年人RA发病原因。为了研究DNA碎片的积累是否会刺激异常的免疫反应，首先测定了健康志愿者、RA患者和骨关节炎(OA)患者外周血样本中TREX1 (DNA碎片清除酶)和cGAS (DNA片段传感器)的基因表达水平。如图1所示TREX1在RA患者中与健康对照组和OA患者相比，TREX1的表达水平显著降低，而cGAS的表达水平显著升高，显示TREX1与RA的发病密切相关。在大鼠模型中，中年健康大鼠血液样本中TREX1和cGAS的转录水平都高于幼年健康大鼠。健康儿童、健康老年人和老年RA患者外周血血清中，健康老年人和老年RA患者血清cfDNA浓度较健康儿童显著升高。此外，与健康老年人相比，老年RA患者的cfDNA积累更高。这些发现可能表明细胞质DNA片段水平随着年龄的增长而增加，DNA片段的积累可能激活cGAS信号级联。此外，TREX1的高水平表达是清除中年大鼠过量DNA碎片的必要条件，可以防止异常的免疫反应，维持动物的健康状态。

图1 TREX1和cGAS在不同人群中的表达水平及相关性

随后通过关节腔、尾静脉内注射DNA碎片，观察AIA大鼠模型的炎症反应，测定体内循环cfDNA的量，并在健康大鼠尾静脉注射DNA碎片，并测定血清DNA碎片浓度。结果显示，注射200 μg DNA片段后，AIA大鼠膝关节腔内出现严重肿胀、红斑、关节僵直等反应。在第9-21天，AIA大鼠的关节炎状况较未注射AIA大鼠更为严重，cfDNA数量显著增加，TREX1的基因表达明显下调，AIA大鼠外周血中cGAS-STING信号调节因子和促炎细胞因子TNF-ɑ, IL-1β, IL-2, IL-6的表达均显著上调。显微CT分析显示，肿胀关节的骨矿物质密度(BMD)、皮质矿物质密度(TMD)、小梁数量和总孔隙度较低，表明静脉注射DNA碎片的AIA大鼠软骨和骨破坏，说明DNA碎片的积累可能促进AIA大鼠的骨破坏。

为了在AIA模型中阐明TREX1在DNA片段致病机制中的作用，通过CRISPR技术介导基因组编辑，在大鼠中完成了cre-loxp介导的TREX1条件性敲除。在AIA模型建立前1周，给TREX1^Cre大鼠注射Cre腺相关病毒。如图2所示，在关节腔内注射DNA碎片后，TREX1^Cre/+ AIA大鼠和健康对照TREX1^Cre/+大鼠的脚掌均出现严重的足肿胀、红斑和关节僵硬。与AIA大鼠相比，AIA模型TREX1^Cre/+大鼠关节炎状况明显加重。健康对照TREX1^Cre/+大鼠通过关节腔注射DNA碎片成功诱导关节炎。CT分析进一步显示，注射DNA碎片的AIA模型TREX1^Cre/+大鼠和健康对照TREX1^Cre/+大鼠的骨密度(BMD)、皮质矿物质密度(Ct.TMD)、骨体积分数、小骨数目、总孔隙度破坏严重并表现出最严重的关节肿胀和软骨侵蚀。

图2 注射DNA片段对TREX1条件敲除(TREX1Cre)大鼠AIA模型炎症的影响

接下来将超声大鼠肌肉DNA碎片经尾静脉注射到健康对照TREX1^Cre/+大鼠和AIA模型TREX1^Cre/+大鼠体内，观察DNA碎片刺激诱导的自身免疫反应，与预期结果一致，注射DNA碎片的健康对照TREX1^Cre/+大鼠和AIA模型TREX1^Cre/+大鼠的肿胀关节和关节炎更严重，骨破坏严重，CD8⁺群比例明显增加，Foxp3细胞群明显减少。

进一步，通过源井生物构建的过表达TREX1的腺相关病毒(AAV-TREX1)注射到大鼠关节腔和尾静脉，如图3所示，A大鼠后爪出现严重肿胀、红斑和关节僵硬。相比之下，与MTX治疗大鼠相似，在关节腔或尾静脉注射AAV-TREX1的AIA大鼠关节炎程度和足体积均明显降低，表明TREX1过表达大鼠AIA的严重程度明显减轻，关节腔或尾静脉注射AAV-TREX1可显著降低AIA大鼠血清中DNA碎片的浓度，表明TREX1可能通过清除DNA片段抑制关节肿胀。总之，这些发现表明TREX1可能通过清除DNA碎片在AIA大鼠关节炎的发展中发挥抑制作用。

图3 TREX1对AIA大鼠的抗炎作用

基于上述体内实验数据，AIA和TREX1^Cre/+模型的SD大鼠均表现出衰老相关分泌表型(SASP)，并且在MTX治疗或注射AAV-TREX1后，这些大鼠的关节炎状况和衰老表型得到逆转，同时促炎细胞因子和衰老标志物如IL-1β、IL-6、IL-8、IFN-β、p16和p21的表达水平降低。因此，TREX1表达量可能与RA发病时的衰老有关，TREX1异常和CFDNA积累可能是促进RA进展发展的危险因素。

衰老是人类不可避免的过程，它与许多疾病的发病有关，包括类风湿性关节炎(RA)。值得注意的是，50岁以后，免疫系统经历了巨大的变化，失去了调节免疫的能力，获得了促炎功能。因此，RA患者的免疫衰老尤其加速。并最终促进凋亡细胞死亡和DNA片段释放。

本文利用腺相关病毒过表达TREX1，建立关节炎疾病模型，首次证明DNA片段可能是诱导RA发展的潜在免疫原性因素，CFDNA浓度升高以及TREX1表达降低可能是机体过早衰老的临床表现之一。TREX1的下调可能有助于RA患者DNA片段的积累，从而通过激活cGAS/STING信号进一步加重炎症反应。将自身免疫组织炎症与衰老联系起来，并确定有效清除DNA片段是预防RA的重要策略。

参考文献：

[1] Luo W D, Wang Y P, Lv J, et al. Age-related self-DNA accumulation may accelerate arthritis in rats and in human rheumatoid arthritis[J]. Nature Communications, 2023, 14(1): 4394.