THP-1过表达稳转细胞系

构THP-1过表达稳转细胞系，轻松锁定炎症/免疫作用机制

THP-1细胞系是一种人单核细胞白血病细胞系，来自一位急性单核细胞白血病患者的外周血液，于1980年被建系，属于悬浮细胞。相对于U937、HL-60、ML-2等白血病细胞系，THP-1更有类似人原代单核细胞的形态和功能特征（包括细胞分化标记）；而相对于人外周血单核细胞（PBMC），THP-1更易在实验室中培养和扩增，且具有更稳定的基因背景，可用于转染或感染实验，利于实验结果的重现。因此，THP-1是各大实验室常用的急性单核细胞白血病细胞系，通过构建THP-1稳转细胞株，可用于研究免疫和炎症的作用机制。

接下来向大家介绍THP-1稳转细胞系在炎症及免疫研究中的应用！

【THP-1巨噬细胞炎症研究】

黄芪多糖(APS)具有抗炎、抗氧化和免疫调节作用。最近的研究发现n6 -甲基腺苷(m6A)在炎症发生中的表观遗传调控作用。然而，APS对m6A的影响尚不清楚。WTAP是m6A甲基转移酶复合体的必需蛋白之一，在m6A的转录过程中起重要作用。本研究通过在THP-1细胞中过表达WTAP，探讨了m6A蛋白在APS调节THP-1巨噬细胞炎症中的作用机制^[1]。

为了研究黄芪多糖调节m6A修饰水平的机制，作者首先检测了黄芪多糖处理是否会影响脂多糖(Lps)诱导的THP-1巨噬细胞中m6A修饰系统相关蛋白的表达。如图1所示，APS处理24 h后，WTAP的mRNA表达明显降低，与其他相关蛋白相比，WTAP蛋白水平也明显降低，表明APS可以通过调节WTAP表达来影响m6A修饰水平。

为了验证APS是否通过WTAP影响IL-6的表达，作者分别用qRT-PCR和WB检测了WTAP过表达后IL-6 mRNA和蛋白的表达。WTAP过表达改善了APS处理的THP-1巨噬细胞中IL-6的低表达(图2)。

图1 APS降低Lps诱导的THP-1巨噬细胞WTAP基因表达

图2 黄芪多糖通过调节WTAP的表达发挥抗炎作用

作者假设WTAP通过NF-KB途径调控IL-6，并通过WB检测APS处理的THP-1巨噬细胞中p65的表达水平。结果显示，APS不影响p65的表达(图3)。WTAP过表达不影响THP-1巨噬细胞中p65的总体表达水平。APS可阻止LPS诱导的THP-1巨噬细胞p65从细胞质向细胞核的易位。然而，在APS处理的THP-1巨噬细胞中，WTAP过表达促进了p65从细胞质向细胞核的易位。为了更好地研究p65的核和细胞质分布，从THP-1巨噬细胞中提取核和细胞质蛋白。结果显示，在转染WTAP过表达质粒的THP-1巨噬细胞中，APS介导的p65向细胞核转运的抑制被逆转。这些结果表明，APS通过WTAP介导的p65核易位调节IL-6的表达。

图3 APS通过WTAP介导的p65核易位调控IL-6的表达

综上所述，作者通过在THP-1细胞中过表达WTAP，研究了WTAP通过调节THP-1巨噬细胞中m6A修饰水平介导APS的抗炎作用，揭示了APS在表观遗传水平调控炎症的新机制。

【THP-1巨噬细胞免疫研究】

苯二氮卓类药物广泛用于麻醉和镇静，并具有免疫调节特性，但其中涉及的细胞靶点和中间信号通路尚不清楚。因此，作者研究了苯二氮卓类药物咪达唑仑对人巨噬细胞的免疫调节作用及其相关的分子机制^[2]。

作者先是探究了咪达唑仑是否可以通过LPS影响巨噬细胞的激活。通过荧光激活细胞分选确定LPS刺激THP-1可上调共刺激CD80的表达，并增加IL-6、TNF-α、IL-10和NO产物(硝酸盐和亚硝酸盐)的培养基浓度(图4)，而咪达唑仑预处理可显著抑制CD80的上调以及IL-6、TNF-α、IL-10和硝酸盐/亚硝酸盐的培养基浓度。此外，咪达唑仑对LPS诱导的促炎分子上调的抑制作用随着咪达唑仑剂量的增加而增强。

作者在LPS刺激前用各种TSPO配体(Ro5-4864、etifoxine和FGIN1-27)和GABAA受体配体(vigabatrin和muscimol)预处理THP-1细胞和PMDMs，研究TSPO受体是否有助于咪达唑伦对巨噬细胞活化的抑制作用。结果显示TSPO配体抑制LPS诱导的CD80上调和LPS增强的IL-6释放。相反，GABAA受体配体既不抑制LPS诱导的CD80上调，也不抑制IL-6释放。TSPO配体降低了LPS诱导的THP-1 Xblue CD14细胞中NF-kB/AP-1的激活。这些结果表明咪达唑仑通过激活TSPO信号传导降低促炎因子的表达，进而阻断NF-kB/AP-1对相关促炎基因的反激活。

为了进一步研究咪达唑仑对LPS处理的THP-1细胞的抑制作用是否依赖于TSPO信号，作者构建了TSPO过表达的THP-1稳转细胞系，比较咪达唑仑对WT型过表达的THP-1细胞的剂量(图4 )。过表达TSPO抑制了CD80和IL-6的基础表达，且咪达唑仑对LPS诱导的CD80和IL-6上调的抑制作用增强(即咪达唑仑敏感性更高)。

图4 咪达唑仑对LPS诱导过表达TSPO的THP-1巨噬细胞的促炎反应的影响

作者观察了咪达唑仑对THP-1细胞NF-KB、i -KBα蛋白及丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)活性的影响。通过过表达转运蛋白(TSPO)证实了TSPO配体参与咪达唑仑免疫调节作用，证明咪达唑仑通过激活TSPO信号通路抑制LPS刺激的人巨噬细胞免疫应答。巨噬细胞活性的抑制可能导致苯二氮卓类药物在危重患者中产生有害副作用。

参考文献：

[1] Long H, Lin H, Zheng P, et al. WTAP mediates the anti-inflammatory effect of Astragalus mongholicus polysaccharide on THP-1 macrophages[J]. Frontiers in Pharmacology, 2022, 13: 1023878.

[2] Horiguchi Y, Ohta N, Yamamoto S, et al. Midazolam suppresses the lipopolysaccharide-stimulated immune responses of human macrophages via translocator protein signaling[J]. International immunopharmacology, 2019, 66: 373-382.