CRISPR-Cas13系统应用于RNA活细胞标记的新进展

国际学术期刊Molecular Cell在线发表了中国科学院分子细胞科学卓越创新中心（生物化学与细胞生物学研究所）陈玲玲研究组关于CRISPR-Cas13应用于RNA活细胞标记的最新研究进展：“Dynamic imaging of RNA in living cells by CRISPR-Cas13 systems”。该研究对多种CRISPR-Cas13蛋白进行酶活突变后，筛选出了具有较好RNA标记能力的dPspCas13b和dPguCas13b蛋白，并且使用优化后的CRISPR-Cas13系统可以对胞浆和胞核的非编码RNA和mRNA进行有效标记。该研究进一步联合dPspCas13b和dPguCas13b蛋白实现了对活细胞内不同RNA的双色标记，与CRISPR-Cas9联用实现了对转录RNA和基因位点同时标记。

而VI类系统又叫CRISPR-Cas13系统，是向导RNA介导的RNA靶向的内切酶系统，从15年被张峰等人发现至今一共鉴定出四个亚型：VI-A(Cas13a/C2c2)，VI-B(Cas13b)，VI-C(Cas13c)和VI-D(Cas13d)，已经开始运用于RNA的敲低，RNA定点编辑，RNA检测以及RNA剪接调控。

为了筛选出标记能力更好的CRISPR-Cas13蛋白，研究人员选取了来源于VI-A(Cas13a/C2c2)，VI-B(Cas13b)和VI-D(Cas13d)三个亚型的8个蛋白，对它们的RNA标记能力进行了比较，发现无论是对于细胞核的长非编码RNA NEAT1还是对于细胞浆的mRNA MUC4来说，来源于VI-B(Cas13b)的dPspCas13b和dPguCas13b都具有较好的标记能力。

进一步对向导RNA (gRNA)的研究发现，gRNA的spacer长度在20到27 nt 的长度有较好的标记效果，更长的gRNA反而会降低甚至会失去标记能力。而gRNA的在目的RNA上的靶向位置对dPspCas13b的标记能力同样有较大差异，进一步说明了RNA的结构对标记能力的影响。研究人员比较CRISPR-Cas13标记系统和传统常用的MS2-MCP系统发现，MS2-MCP标记系统因为插入的MS2重复元件而具有更强信号，但是会影响目的RNA 表达；而CRISPR-dPspCas13b对目的RNA表达没有影响。通过对NEAT1所组成的paraspeckle进行动态观察，发现CRISPR-Cas13标记系统和MS2-MCP对paraspeckles的运动能力都不会产生影响。长时间动态追踪发现paraspeckles之间可以相互融合和分裂，并提出了“hit-run/fusion”模型，解释长形paraspeckle的形成过程。

为进一步实现RNA单分子水平标记，研究人员构建了一系列带有不同数目重复元件的RNA序列，发现当目的序列带有12个及以上重复元件时，通过靶向这些重复元件，dPspCas13b可以在单分子水平实现对目的RNA的标记。此外，联合dPspCas13b和dPguCas13b蛋白，研究人员实现了对同一RNA和两个不同RNA的双色标记，为研究两个RNA之间的相互关系提供了一个新的工具。此外，联合CRISPR-dCas13系统与CRISPR -dCas9系统，研究人员也实现了对基因转录的RNA和基因位点的同时标记，为研究RNA转录和RNA与基因位点的关系，提供了一个简单和便利的新手段。