利用CRISPR平台来快速检测新冠病毒

新冠肺炎疫情的暴发，凸显出核酸检测的重要性。灵敏而特异的核酸检测，对于临床诊断和基因分型都至关重要。不过，许多核酸检测方法缺乏检测低浓度核酸的灵敏度或特异性，或者过于昂贵和复杂，在标准实验室之外无法使用。对于新型冠状病毒，qPCR虽然是诊断金标准，但在疫情刚刚暴发时，许多国家都面临检测试剂不足的问题。

好在，科学家利用Cas9蛋白的变体Cas13和Cas12a开发出简单而经济的平台，能够可靠检测极低浓度的核酸。正如我们之前所介绍的，Broad研究所的张锋实验室利用Cas13蛋白的天然RNase活性开发出SHERLOCK和SHERLOCK v2方法；而加州大学伯克利分校的Jennifer Doudna实验室则开发出一种称为DETECTR的方法。

SHERLOCK和DETECTR分别利用Cas13和Cas12a对邻近ssRNA和ssDNA进行切割和降解，以此切割和激活报告基团。随后对这个报告基团产生的信号进行测定，即可确定感兴趣的DNA或RNA是否存在。这两个系统的开发者近日都发布了快速检测新冠病毒的方案。

SHERLOCK

下面我们先来回顾一下SHERLOCK的工作原理。在crRNA的引导下，Cas13识别目标序列并结合，这激发了它对周围ssRNA分子的“胡乱”切割。SHERLOCK系统将荧光淬灭的ssRNA报告基团添加到反应中。激活的Cas13切割RNA后，产生可定量的信号，表示目标核酸的存在。

为了提高分析的灵敏度，样品中的DNA或RNA首先经过重组酶聚合酶扩增（RPA）或RT-PRA扩增。RPA与T7转录相结合，将扩增后的DNA转化为RNA，便于后续的Cas13检测。这种扩增步骤使得SHERLOCK的灵敏度达到渺摩尔（attomolar，10^-18 M），特异性达到单碱基错配。之后，他们又开发出灵敏度更高的多重检测平台SHERLOCK v2。

在新冠肺炎疫情暴发后，张锋等人共享了利用SHERLOCK检测SARS-CoV-2 RNA的操作方案。该检测利用从患者样本中纯化出的RNA作为起始样本，通过试纸条浸润来读取检测结果，而无需进行复杂的仪器操作。

具体检测方案分为三个步骤，可在一小时内完成。

第1步：孵育25分钟 – 利用市售的PRA试剂盒等温扩增核酸样品；
第2步：孵育30分钟 – 利用Cas13检测预扩增的病毒RNA序列；
第3步：孵育2分钟 – 利用试纸条肉眼观察检测结果

DETECTR

DETECR的工作原理与SHERLOCK相似。Cas12a通过crRNA靶向特定的DNA序列，同时将ssDNA-荧光淬灭（FQ）报道基团加入反应中，它在ssDNA降解时产生信号。为了提高灵敏度，首先通过RPA的等温扩增来扩增DNA。当Cas12a-crRNA与目标dsDNA配对时，Cas12a的DNase活性启动。随后，周围的ssDNA被降解，包括ssDNA-FQ报道基团在内。荧光信号可指示您感兴趣的DNA是否存在。

DETECTR能够高效检测混合样本中的核酸，适合一系列分子和临床诊断应用。基于DETECTR技术的Mammoth Biosciences公司已成立，它的目标是提供基于CRISPR的平台 ，并以此为基础开发各种生物传感的检测。

近日，Mammoth Biosciences和加州大学旧金山分校的研究人员借助DETECTR平台，开发出SARS-CoV-2的快速检测。这项成果发表在《Nature Biotechnology》杂志上。

SARS-CoV-2 DETECTR的流程如上图所示。从患者的鼻咽拭子中提取RNA之后，将其作为DETECTR的起始材料。之后进行LAMP预扩增，并利用Cas12检测病毒的E基因、N基因和RNase P，最后通过荧光分析仪或侧向流检测试纸来查看结果。整个过程可在一小时内完成，也不需要复杂的仪器。不过，与SHERLOCK系统一样，DETECTR也尚未经过批准用于临床诊断。