张锋团队推出新冠病毒CRISPR检测技术

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张锋团队推出新冠病毒CRISPR检测技术

Broad研究所的著名学者张锋教授和他在Broad研究所，麻省理工学院（MIT）麦戈文脑科学研究所（McGovern Institute for Brain Research）的合作伙伴一起，公布了他们开发的新一代新冠病毒CRISPR检测技术的实验流程。今年2月，张锋教授和他的合作伙伴曾经开发出一项基于CRISPR的新冠病毒检测技术，不需要复杂的设备，三步检测仅需约1个小时，就能检查出新冠病毒RNA的存在。

这款最新的检测手段比2月份的检测技术更进一步，检测过程中不需要从患者样本中纯化RNA，并且将检测新冠病毒所需的化学反应步骤在一个试管中完成。研发团队将它命名为STOP（SHERLOCK Testing in One Pot）。在检验12个新冠病毒阳性和5个新冠病毒阴性样本的实验中，这一检测达到100%的特异性和97%的灵敏度。不过科学家们也强调，这一检测方法还没有获得FDA的批准，尚不能用于临床上对新冠病毒感染的诊断。

利用CRISPR检验新冠病毒的技术原理

目前，诊断新冠病毒感染的主要检测手段是qPCR，然而，qPCR所需的试剂和设备并不是总是容易获得，而且样本通常要运送到中央实验室中进行检测，可能延误对患者的诊断和治疗时间。为了推进对疾病的即时（point-of-care）诊断，研究人员力图使用CRISPR编辑技术开发简易、灵敏的分子诊断检测。张锋教授团队在2017年于《科学》杂志上发表的基于CRISPR的SHERLOCK技术。这个技术与夏洛克·福尔摩斯同名，为“Specific High Sensitivity Enzymatic Reporter UnLOCKing”技术的缩写。从名字上看，它具有特异的高灵敏度。

SHERLOCK的核心是一种叫做Cas13a的蛋白酶和与其结合的向导RNA。根据新冠病毒的RNA序列，研究人员们精心设计了能够靶向新冠病毒特异性序列的向导RNA。理论上讲，只要样本里有新冠病毒所对应的RNA，向导RNA就能对其进行精准的识别，并激活与其结合的Cas13a蛋白酶。Cas13a是一种很有趣的酶，一旦被激活，它就会不分青红皂白，切开所遇到的任何RNA分子。也正是利用这种特性，研究人员们在样本里还会添加一种通过RNA相连接的特殊分子。一旦Cas13a得到激活，这种特殊分子上的RNA就会被切断。这样一来，通过确认这些分子有没有被切断，我们就能知道最初的样本里有没有新冠病毒的存在。

后续的检测步骤与市场上的怀孕检测很相似，将反应后的样本滴在能够识别“完整分子”和“切断分子”的试纸上，如果样本里不存在新冠病毒，那么试纸标识“完整分子”的较低位置上，就会出现一条条带；相反，如果样本里真的有新冠病毒对应的RNA，那么在代表“切断分子”的较高位置上，会出现另一条条带。通过条带位置的不同，我们很容易就能确认新冠病毒的存在与否。

张锋教授和他的合作伙伴在今年2月发布的新冠病毒检测技术就是基于这一原理。随后，加州旧金山大学（UCSF）的Charles Chiu教授与Mammoth Biosciences公司的联合研究团队，以及阿根廷的布宜诺斯艾利斯大学和CASPR Biotech的联合研究团队也开发了基于Cas12的新冠病毒CRISPR检测技术。然而，这些基于CRISPR的新冠病毒检测都需要两个反应步骤，第一个步骤是使用等温扩增（isothermal amplification）反应扩增RNA的数量，然后将扩增的样本加入到包含Cas酶和其它反应试剂的试管中进行检测反应。这不但增加了检测流程的复杂性，而且更多的样本转移步骤可能带来的污染。

将等温扩增和Cas酶反应合二为一的STOPCovid检测

因此，张锋教授和他的合作伙伴致力于开发一种更为简便的检测手段，让扩增RNA数目的等温扩增步骤和Cas酶检测的化学反应能够在同一个试管中进行。为此，他们选择了环介导等温扩增技术（Loop-mediated Isothermal Amplification， LAMP）作为扩增RNA的方法。这一选择也有其实用方面的原因，因为LAMP所需的试剂并不难于获取。然而LAMP反应需要在温度为60℃的反应条件下进行，而Cas13a在这一温度下不够稳定。研究人员找到了名为AapCas12b的Cas酶，能够在LAMP反应条件下维持足够的活性，同时对指导RNA和反应中的添加剂进行了优化，让Cas酶介导的检测步骤维持足够的灵敏度。在实验条件下，这一检测的下限为100个新冠病毒RNA分子。研究人员同时简化了提取RNA的步骤，只需要在含有新冠病毒的咽拭子或唾液样本中加入裂解病毒，释放RNA的试剂，无需纯化分离RNA，就可以将释放的病毒RNA用于检测。

STOPCovid在检测患者样本时表现出100%特异性

在今年2月发布的研究中，由于患者样本的稀缺，研究人员只使用合成的RNA对新冠病毒CRISPR检测的表现进行了评估。这次，研究人员使用12个新冠病毒阳性和5个新冠病毒阴性患者咽拭子样本对STOPCovid检测的特异性和灵敏度进行了检验。每个样本都进行了三重测试（triplicate）。实验结果表明，在5个新冠病毒阴性的样本中，STOPCovid没有给出任何假阳性结果，而在12个新冠病毒阳性样本中，STOPCovid在11个样本的三次测试中都给出阳性结果，在1个样本的三次测试中两次给出阳性结果。研究人员表示，他们已经准备了一些初始试剂盒，能够让其它的研究人员进一步开发这一检测平台。研究团队已经与美国FDA进行交流，探索获得紧急使用授权（EUA）所需要的步骤。张锋教授在访谈中表示，这一检测的独特之处在于将化学反应简化为一个步骤，从而防治在多步反应中因为转移液体可能带来的样本污染。这使它更适合作为即使检测使用。

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