Nature今日头条：CRISPR也有不能切割的基因组片段？！

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细菌和感染细菌的病毒都参与了分子生命备战，它们和我们人体的生命一样古老，进化为细菌配备了一系列免疫酶，比如CRISPR-Cas系统，可以靶向并破坏病毒DNA.但是，杀死细菌的病毒（也称为噬菌体）也有自己的工具，帮助它们克服甚至最强大的细菌防御能力。

来自加州大学旧金山分校和圣地亚哥大学圣地亚哥分校的科学家们发现了一种令人意外的新机制，一些噬菌体可以用来避免被这些DNA切割酶切割。在感染细菌后，这些噬菌体在细菌内部组构了难以穿透的“安全室”，保护脆弱的噬菌体DNA免受抗病毒酶的侵害。这种类似于细胞核的区室是病毒中发现的最有效的CRISPR屏障。


这一有趣的发现公布在12月9日Nature杂志上。


文章作者，加州大学旧金山分校微生物学和免疫学系助理教授Joseph Bondy-Denomy说，“通过我们的实验发现，这些噬菌体并未屈服于任何靶向DNA的CRISPR系统。这是首次发现噬菌体表现出这种泛CRISPR抗性。”


CRISPR无法切割的DNA


为了找到抗CRISPR的噬菌体，研究人员从五个不同的噬菌体家族中选出病毒，并用它们感染经过基因工程改造的携带四种不同Cas酶的普通细菌，Cas酶是CRISPR系统的DNA切割成分。


研究表明这些经过CRISPR强化的细菌在对抗它们所面对的大多数噬菌体方面取得了胜利。但是有两个巨型噬菌体（它们的基因组比一般研究的噬菌体基因组大五到十倍）不会被四个CRISPR系统切割。


研究人员决定对这些巨型噬菌体进行检测，探究其CRISPR抗性的极限。他们让这些噬菌体接触完全不同类型的CRISPR细菌，还有有限制性修饰系统的细菌（一种比CRISPR更常见的DNA裂解酶（在大约90％的细菌物种中发现了限制性系统，而因为CRISPR仅存在约40％）。结果显示：培养皿中散落着噬菌体感染细菌的残留物。


“这真是令人惊讶，因为我们将细菌改造成能大量过量生产免疫系统，但是它们中的任何一个都不能切割噬菌体DNA.这些噬菌体对所测试的所有六个细菌免疫系统均具有抗性，” Bondy-Denomy说。


看来，巨噬细胞是坚不可摧的。但是试管实验得到了相反的结果，巨型噬菌体DNA实际上像其他任何DNA一样容易受到CRISPR和限制酶的攻击。那么这是为什么呢？


研究人员认为，在噬菌体感染的细胞中观察到的CRISPR抗性必须是病毒产生的某种东西干扰CRISPR的结果。


结果证明Anti-CRISPRs是罪魁祸首。这些蛋白质由Bondy-Denomy于2013年首次发现，是某些噬菌体基因组中编码的有效CRISPR灭活剂。但是当研究人员分析巨型噬菌体基因组序列时，却找不到Anti-CRISPRs基因。另外，每种已知的Anti-CRISPRs只能禁用特定的CRISPR系统，而巨型噬菌体对作用其上的每种抗病毒酶均具有抗性。因此保护巨型噬菌体DNA的方法都应该是基于其他机制。


难以穿透的CRISPR盾


当巨型噬菌体感染细菌时，它们会在宿主细胞的中间建立一个球形区室，将抗病毒酶拒之门外，为病毒基因组的复制提供“安全空间”。


事实证明，这个区室与UCSD教授Joe Pogliano博士和UCSF教授David Agard博士于2017年首次发现的相同，他们都是这项新研究的合著者。尽管这些研究人员先前已证明噬菌体基因组在此核样外壳中复制，但直到现在为止还没有人知道该外壳还可以作为针对CRISPR的不可穿透的屏障。


尽管如此，关于外壳和构建外壳的病毒的许多问题仍未得到解答，包括构建外壳蛋白质的基本细节。


当研究人员在显微镜下监视噬菌体感染的细菌时，他们注意到了一些不寻常的现象：在组装噬菌体的安全室时（这一过程大约需要30分钟），其基因组仍保留在将其注入宿主细胞的位置。在这段时间内，噬菌体基因组似乎易受宿主细胞周围漂浮的任何抗病毒酶的攻击。但是不知何故，当安全室正在建设中时，基因组仍保持完整。


研究人员还发现，外壳并不像最初的实验所建议的那样坚不可摧。他们通过一些巧妙的工程设计，找到了一种方法，可以通过在一种病毒外壳蛋白上连接限制性酶来绕开类似核的屏蔽层。这种特洛伊木马策略使DNA切割限制酶可以在组装过程中潜入壳中，并在原本被认为是无免疫力的区域内切碎噬菌体基因组，从而使细菌得以生存。


这项实验令研究人员感到兴奋，因为它表明实际上有一些方法可以突破“难以穿透的”安全室。考虑到细菌和噬菌体一直在寻找破坏对方防御的新方法， Bondy-Denomy认为，科学家最终将发现细菌已经具备了突破或绕过该区室所需的工具。

Bondy-Denomy说：“我们正在寻找细菌绕过壳层的方式。也许有些细菌将免疫酶融合到噬菌体蛋白上，然后进入外壳。或者细菌会盗取噬菌体基因并将其用于噬菌体。我认为我们最终会发现细菌中有很多细菌与构建这些外壳的噬菌体作斗争的方法，我们可能会对它们的操作方式感到惊讶。”

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