prime editing：为CRISPR编辑增添精确性和灵活性

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最近，Broad研究所的David Liu实验室开发出一种新技术，为CRISPR编辑世界增添了一份精确性和灵活性。

目前已从人类中鉴定出75,000多个致病性的遗传变异。之前开发的基因组编辑方法只能纠正这些变异中的一小部分。最近，Broad研究所的David Liu实验室开发出一种新技术，为CRISPR编辑世界增添了一份精确性和灵活性。


这种新方法名为“prime editing”，于上个月发表在《Nature》杂志上。这是一种“搜索和替换”的基因组编辑技术，可以介导靶向的插入、缺失以及所有的碱基替换。而且，它可以将不同类型的编辑相结合。所有这些都可以在没有双链断裂（DSB）或供体DNA模板的情况下进行。


它的原理如何？首先，将经过改造的向导RNA（pegRNA）与prime editor蛋白相结合，pegRNA具有双重功能，既能够将编辑蛋白引导到目标位点，又含有编辑的模板序列。prime editor蛋白则由Cas9切口酶和逆转录酶融合而成。在Cas9切割目标位点之后，逆转录酶以pegRNA作为模板进行逆转录，然后将DNA直接聚合到切口的DNA链上。

prime editor：Cas9与逆转录酶的融合体


为了减少引入细胞的元件，研究人员将M-MLV逆转录酶与Cas9 H840A切口酶相融合，形成prime editor（PE）。他们还发现方向很重要，将逆转录酶融合到Cas9切口酶的C端可以提高编辑效率。他们将这种复合物成为PE1。


之后，David Liu实验室创建并评估了19种带有RT突变的PE1变异体。这些变异体可提高活性，增强模板与位点的结合，提高持续合成能力或改善热稳定性。最后，他们将Cas9切口酶与M-MLV逆转录酶的五突变体相融合，将其称之为PE2。与PE1相比，PE2在不同位点的编辑效率平均高2.3到5.1倍。


pegRNA：多功能的向导RNA


prime editing的另一重要元件是向导RNA（pegRNA）。它既是向导RNA，又编码了逆转录的模板。与带切口的基因组DNA链互补的序列可以作为引物结合位点（PBS）。PBS序列与目标位点杂交，并作为逆转录的起始点。


PE3：解离错配的DNA


一旦prime editing在一条链上合成编辑物，那么一条链上的原始序列与另一条链上的编辑序列之间将存在错配。为了指导异源双链的解离以利于编辑，研究人员采用一种之前开发的策略。他们在未编辑的链上引入切口，让细胞利用编辑过的链作为模板来重新合成第二条链。


这种prime editing系统就称为PE3，它还需要另外一条sgRNA。利用这条sgRNA，prime editor复合物将未编辑的链切开（此切口与第一次的切口相距甚远，以避免产生双链断裂），从而将编辑效率提高2到3倍。


prime editing有何优点？


不大受PAM序列的限制


prime editor扩展了CRISPR基因组编辑的范围，因为它可以在靠近或远离PAM位点的位置进行编辑，而不大像其他方法那样受到PAM的限制。对于prime editing，PAM到编辑点的距离可以超过30 bp。


碱基编辑更精确（在某些情况下）


之前开发的Base editor只能实现四种类型的碱基替换（C->T、G->A、A->G和T->C），而prime editing可实现所有12种可能的碱基替换。同时，它也更精确。例如，Base editor会编辑窗口内的所有C或A，而prime editor只编辑pegRNA指定的对象。如果你无法接受bystander编辑，建议选择prime editor。


不过，在某些情况下，传统的Base editor却是首选。比如，如果目标核苷酸在经典的碱基编辑窗口内，那么碱基编辑的效率更高，插入缺失更少。不过，如果核苷酸位置不佳，那么prime editing效率更高，因为它对PAM位点的依赖性较低。


副产物更少


在双链断裂后往往采用同源介导修复（HDR）来实现精确的编辑。但是，Cas9切割的效率较高，而HDR的效率较低。这意味着大多数双链断裂都是通过非同源末端连接来修复的。因此，HDR的效率往往低于10%。相比之下，prime editing在HEK293T细胞中的编辑效率可达到20-50%。


作为一种新的基因组编辑方法，prime editing还需要更多的研究。作者在论文中指出，有必要在全基因组范围内研究其脱靶效应，鉴定prime editor对细胞的影响，并评估体外和体内导入策略。


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相关文献

Anzalone, A.V., Randolph, P.B., Davis, J.R. et al. Search-and-replace genome editing without double-strand breaks or donor DNA. Nature (2019) doi:10.1038/s41586-019-1711-4

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