基因敲除Atg7细胞

与自噬有关的Atg7是细胞降解和再循环的必需蛋白。该序列与自噬体膜的独特发展和细胞内融合所需的泛素-蛋白酶体系统UPS有关。在自噬启动过程中，Atg7就像E-1酶一样作用于泛素样蛋白（UBL），例如Atg12和Atg8。基因敲除细胞系Atg7与这些UBL蛋白结合并激活其向E-2酶的转移，以帮助其靶向分子。Atg7在这两个自噬特异性UBL系统中的作用使其成为自噬体组装的重要调节剂。

顶体是一种特殊的细胞器，覆盖在精子核的前部，在受精过程中起着至关重要的作用。这种溶酶体相关细胞器（LRO）的生物发生的分子机制仍是未知的。在这项研究中，具有Atg7基因敲除生殖细胞的小鼠由于顶体生物发生缺陷而变得不育，并表现出类似于人球虫病的表型。通过将精子注射到细胞质中可以成功地挽救这种生殖缺陷。此外，在生殖细胞中敲除Atg7不会影响生殖细胞发育的早期阶段，但在精子发生的后期阶段，前体囊泡在高尔基期不能融合为单个顶体囊泡，从而导致精子不规则或几乎呈圆形头。自噬通量在Atg7基因敲除的生殖细胞中被破坏，最终导致LC3与高尔基体来源的囊泡结合失败。此外，在顶体生物发生的过程中，Atg7部分调节与精子疾病有关的另一种蛋白质，即高尔基相关的PDZ和一种含有卷曲螺旋基序（GOPC）的蛋白质。最后，将自噬或溶酶体抑制剂注入睾丸会产生类似于生殖细胞特异性Atg7基因敲除小鼠的表型。

在40岁以下的女性中，约1-2％的原发性卵巢功能不全（POI）是导致不育的常见原因。但是，导致POI的机制仍知之甚少。在这种情况下，必需的自噬诱导基因Atg7的生殖细胞特异性敲除导致雌性小鼠不育。 Atg7基因敲除妇女的亚生育力是由严重的卵泡丢失引起的，这与人类POI患者非常相似。 Atg7生殖细胞的突变或自噬机制的缺陷可能是POI的原因。进一步的研究表明，敲除特异于生殖细胞的Atg7基因会导致新生儿过渡期生殖细胞的过度损失。另外，体外研究还表明自噬可以保护处于饥饿状态的新生卵巢的卵母细胞免受细胞凋亡的过度损失。

与人类患者的POI相似，Atg7基因敲除小鼠的卵巢卵泡池急剧减少。因此，Atg7突变或自噬机制缺陷可能是POI的原因。

巨自噬/自噬被认为是进化上保守的细胞分解代谢过程。在这里，研究人员研究了自噬对动脉粥样硬化中血管平滑肌（VSM）细胞的影响。敲除必需自噬基因Atg7的小鼠中培养的VSM细胞显示血清诱导的细胞生长减少，细胞死亡增加和细胞增殖速率降低。此外，在源自Atg7基因敲除小鼠的VSM细胞中，激活了TRP53（人和大鼠TP53的小鼠直系同源物），并且7-酮胆固醇增强了细胞凋亡和CCL2（趋化因子[CC基序]配体2）的表达。此外，在10周龄时，与Apoe（载脂蛋白E）敲除小鼠杂交的Atg7敲除小鼠在降主动脉中显示出减少的内侧细胞增殖和增加的TUNEL阳性细胞。有趣的是，将Atg7基因敲除小鼠与Apoe基因敲除小鼠杂交，并喂食含1.25％胆固醇的西方饮食14周，其存活率下降。对与Atoe7基因敲除小鼠杂交的Atg7与基因敲除小鼠的降主动脉的分析显示，斑块面积增加，TUNEL阳性区域增加，VSM阳性细胞区域减少以及培养基中巨噬细胞的积累。 VSM细胞中的自噬缺陷可通过动脉向外重塑增强动脉粥样硬化的改变。

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方案1：小片段基因敲除方案，gRNA设在外显子2两端的内含子中，敲除外显子编码碱基数为非3倍数，敲除后可造成移码。

方案2：移码基因敲除方案，gRNA设在外显子上，缺失的碱基数为非3倍数，敲除后可发生移码突变。

方案3：大片段基因敲除方案，将整个基因的编码序列敲除，达到大片段敲除的效果。

Reference

Wang H, Wan H, Li X, et al. Atg7 is required for acrosome biogenesis during spermatogenesis in mice. Cell Res. 2014;24(7):852-869. doi:10.1038/cr.2014.70. 

Song ZH, Yu HY, Wang P, et al. Germ cell-specific Atg7 knockout results in primary ovarian insufficiency in female mice. Cell Death Dis. 2015;6(1):e1589. Published 2015 Jan 15. doi:10.1038/cddis.2014.559.

Osonoi Y, Mita T, Azuma K, et al. Defective autophagy in vascular smooth muscle cells enhances cell death and atherosclerosis. Autophagy. 2018;14(11):1991-2006. doi:10.1080/15548627.2018.1501132.