基因敲除A549细胞系

|简介|：

A549细胞系是于1972年建立的人类非小细胞肺癌细胞系。科学家通过一位58岁的白种人男性的腺癌肺组织的外植体肿瘤转移并培养了该细胞系。在肺组织中发现的A549细胞是鳞状细胞，负责水和电解质在整个肺泡中的扩散，还可以通过胞磷胆碱途径合成含有高度不饱和的脂肪酸和卵磷脂。相比之下与小细胞肺癌（SCLC），该细胞系的侵袭性较小且扩散速度较慢，但事实证明它更为普遍，占所有肺癌病例的85-88％。 A549细胞已成为II型肺泡上皮细胞的基因敲除细胞模型，这意味着基因敲除A549细胞系可用于研究肺组织的代谢过程以及药物向组织的可能传递机制。该细胞系目前被用作体外和体内模型，通过一些基因编辑技术（例如CRISPR / Cas 9）研究肺癌和正在开发的药物疗法，这使A549成为适合基因敲除的细胞系。

A549细胞的快速繁殖可以归因于环氧合酶2的显着表达。在体外培养A549细胞时，它们通常会生长成附着或紧密依附着培养基的单层细胞。当生长时间足够长时，A549细胞即将经历细胞的分化。 A549细胞可用于病毒研究和相关蛋白质表达的变化。另外，由于这些细胞是合适的转染宿主，因此它们已被用作紫杉醇和贝伐单抗的试验场所以开发新的肺癌药物。

|应用|：

使用CRISPR指导的基因编辑方法创建NRF2基因敲除A549细胞系

 越来越明显的是，CRISPR指导的基因编辑将对癌症和遗传性疾病的新治疗方法的发展产生重大影响。随着对癌症治疗组合方法关注发展，建立起了基因编辑技术，可以敲除靶基因这一事实至关重要。研究人员利用CRISPR/Cas9通过破坏NRF2核输出信号（NES）域的功能性来禁用肺癌细胞A549中的NRF2基因。该蛋白质在培养后被大量阻止到转移细胞核中。并且在细胞的组织培养中慢慢地产生了稳转细胞株的构建，发现有基因敲除A549细胞具有降低的表型，并且对化学治疗剂（例如顺铂和卡铂）更敏感。这些观察结果在异种移植小鼠模型中得到了证实，即使在没有药物治疗的情况下，纯合的原代的基因敲除A549细胞的增殖速度也比野生型细胞慢。肿瘤生长被阻止到16天，在接受CRISPR指导的基因编辑和化疗联合作用的样品中观察到肿瘤体积显着减少。

CRISPR/Cas9基因编辑技术，可在染色体内的特定位点识别并执行DNA切割，效率出乎意料，并且精度更高。CRISPR/Cas9的天然活性是使细菌感染的细胞病毒基因组失活，随后人类细胞中CRISPR/Cas9的遗传功能改造，提供了腺相关病毒的可能性。研究人员利用CRISPR/Cas9催化的特定基因破坏来提高常用抗癌治疗方法的有效性，例如化学疗法或免疫疗法。

在这种情况下，研究人员将NRF2基因作为目标，因为它是细胞排毒以及对氧化和亲电子应激反应的中央调节器。当细胞进入压力环境（例如遇到有毒物质）时，NRF2的表达增加。因此，通过破坏NRF2，该结果表明了化学治疗剂，例如顺铂和卡铂，将更有效地工作并且剂量更低。从广义上讲，这种方法最终将导致产生相同的杀肿瘤活性所需的化学疗法水平降低，从而改善癌症患者的生活质量。公认的非小细胞肺癌细胞系A549在KEAP1的Kelch结构域中具有了一个突变，导致NRF2的过度表达，它经常被用作发现针对癌症的新型治疗药物的金标准。

使用CRISPR/Cas9介导的基因组编辑敲除GluIIβ可通过抑制受体酪氨酸激酶活性来抑制A549细胞的生长和转移潜力。

基因敲除切割效率不仅可以让人具有生成蛋白基化谱和建立调控记录的能力，而且具有多种优势，是一种特别有吸引力的重组蛋白表达系统。首先，它在谷氨酸上羧基化，在酪氨酸上硫酸化。第二，操作简单，通过瞬时基因表达可以快速产生重组蛋白。第三，可用于稳定的重组蛋白生产。一些研究人员利用基因敲除切割效率系统产生基因编辑细胞系，对GLUL基因组位点进行靶向测序，产生了EPO的稳转细胞系，并发现重组促进红细胞生成素在人体内稳定表达的机制。 

源井生物根据客户需求，结合靶基因的情况进行基因稳转敲除方案设计。

方案1：小片段基因敲除方案，gRNA设在外显子2两端的内含子中，敲除外显子编码碱基数为非3倍数，敲除后可造成移码。

方案2：移码基因敲除方案，gRNA设在外显子上，缺失的碱基数为非3倍数，敲除后可发生移码突变。 

方案3：大片段基因敲除方案，将整个基因的编码序列敲除，达到大片段敲除的效果。