基因敲除CHO细胞系

CHO细胞也称为中国仓鼠卵巢细胞，这是一种起源于中国仓鼠卵巢的上皮细胞系。 中国仓鼠卵巢（CHO）细胞，基因敲除已成为制造治疗性重组蛋白的主要动力。该稳转细胞株通常用于生物学和医学研究。而且，就治疗蛋白的工业生产而言，它是最广泛使用的哺乳动物宿主。

应用：

基因靶向法构建基因敲除CHO稳转细胞系

由于CHO稳转细胞系是产生治疗性抗体的主要宿主，因此构建生产性CHO稳转细胞系非常重要。构建特征性CHO稳转细胞系通常使用两种主要的转染方法，一种是随机整合，另一种是基因靶向。前一种会引起抗体生产率的变化，通常会影响转基因表达水平。

但是，在基因靶向方法中，将外源基因插入特定的染色体区域。该方法基于同源重组，该同源重组使用靶向宿主稳转细胞株的特定基因组区域的序列。研究人员将CRISPR/Cas9系统用作基因靶向方法，该方法通过引导RNA和Cas9诱导双链断裂（DSB），从而提高了同源重组的效率。因此，CRISPR/Cas9载体系统可以有效地将外源基因插入CHO稳转细胞系。

使用谷氨酰胺合成酶基因敲除稳转细胞构建提高CHO稳转细胞系的产生效率

尽管中国仓鼠卵巢（CHO）稳转细胞系以其独特的特性已成为制造治疗性重组蛋白的主要力量，但是CHO稳转细胞株生成（CLG）的主要挑战之一是如何有效地识别那些稀有的，在大量低产和非生产性克隆中产生克隆。当前，已经广泛使用了两个主要的CHO表达系统，即基于二氢叶酸还原酶（DHFR）的甲氨蝶呤（MTX）选择和基于谷氨酰胺合成酶（GS）的甲硫氨酸亚砜亚胺（MSX）选择。

ZFN技术的优势，特别是在CHO敲除细胞系。通过观察所有GS 基因生长的谷氨酰胺，实现这种高水平的技术。

谷氨酰胺合成酶介导的选择的表征，用于建立产生单克隆抗体的重组CHO稳转细胞

通过GS基因敲除细胞株CHO稳转细胞构建启动子工程，即使在没有MSX1的情况下，基于GS的系统也可以有效地产生稳转细胞系。使用两种不同的宿主细胞系（CHO-K1和GS敲除CHO（GS KO）），通过在不同MSX浓度下的单轮选择产生了mAb的rCHO细胞克隆。

具有改进的选择严格性的GS敲除CHO细胞系。 在没有MSX的情况下，使用GS敲除CHO宿主细胞系可促进高产克隆的快速产生，而乳酸和氨的产生减少.mAb产生克隆和长期培养进行测试的过程示意图 生产稳定。

现在的技术不仅可以让人具有生成蛋白基化谱和建立调控记录的能力，而且具有多种优势，基因敲除切割效率是一种特别有吸引力的重组蛋白表达系统。首先，它在谷氨酸上羧基化，在酪氨酸上硫酸化。第二，操作简单，通过瞬时基因表达可以快速产生重组蛋白。第三，可用于稳定的重组蛋白生产。一些研究人员利用基因敲除切割效率系统产生基因编辑细胞系，对GLUL基因组位点进行靶向测序，产生EPO的稳转细胞系，并发现重组促红细胞生成素在人体内稳定表达的机制。

源井生物根据客户需求，结合靶基因的情况进行基因稳转敲除方案设计。

方案1：小片段基因敲除方案，gRNA设在外显子2两端的内含子中，敲除外显子编码碱基数为非3倍数，敲除后可造成移码。

方案2：移码基因敲除方案，gRNA设在外显子上，缺失的碱基数为非3倍数，敲除后可发生移码突变。

方案3：大片段基因敲除方案，将整个基因的编码序列敲除，达到大片段敲除的效果。

Reference:

Fan L, Kadura I, Krebs LE, Hatfield CC, Shaw MM, Frye CC, Improving the efficiency of CHO cell line generation using glutamine synthetase gene knockout cells.Aga, M., Yamano, N., Kumamoto, T. et al. Construction of a gene knockout CHO cell line using a simple gene targeting method. BMC Proc 9, P2 (2015). Noh, S.M., Shin, S. & Lee, G.M. Comprehensive characterization of glutamine synthetase-mediated selection for the establishment of recombinant CHO cells producing monoclonal antibodies. Sci Rep 8, 5361 (2018).