干细胞相关实验总踩坑？一文梳理核心难点与高效破局思路！

干细胞被誉为“生命的种子”，其高度的可塑性与基因编辑、文库筛选相结合，正在以前所未有的精度与规模改写着我们理解生命、研究疾病和开发疗法的方式。从发育机制的探索到疾病模型构建，从药物筛选到个性化治疗，干细胞研究正在飞速推动着医学的进步和发展。

干细胞是一类具有“干性”的原始细胞，具有不断复制的自我更新能力，以及分化为体内多种功能细胞的潜能。根据分化能力的不同，干细胞大致可分为：

1.全能干细胞：具有发育为完整个体的潜能，如受精卵；

2.多能干细胞：能够分化为几乎所有的人体细胞，如胚胎干细胞（Embryoinc Stem Cells, ESCs）和诱导多能干细胞（induced Pluripotent Stem Cells, iPSCs）；

3.专能干细胞：能够分化为特定谱系类型的细胞。

其中，在人的研究体系中，人多能干细胞（human Pluripotent Stem Cells, hPSCs）因其来源广泛、伦理争议小、可个性化制备等优势，成为科研与应用上最理想的选择之一，小源也将以人多能干细胞为例子，给大家讲解干细胞研究思路——如何将基因编辑与文库筛选相结合，以及其中的关键要点。

CRISPR/Cas9系统是目前最为常用与有效的基因编辑体系，不仅适用于个体与细胞的基因敲除、点突变或敲入等编辑操作，还能应用于大规模的文库筛选，寻找未知功能靶点。

人多能干细胞与CRISPR/Cas9系统相结合，可广泛应用于：

1.多能性维持和早期胚胎发育的调控机制研究

2.疾病机制探索和药物开发

3.功能细胞的工程化改造

4.细胞个性化治疗

5.基于干细胞体系的CRISPR筛选

图1. CRISPR/Cas9系统在人多能干细胞上的应用

虽然人多能干细胞在CRISPR/Cas9体系上应用广泛，但由于其生理特点与培养体系的特殊性，相对于常用的细胞系，人多能干细胞在常规的基因编辑上是存在较大的技术难点和应用门槛的，主要有以下几点：

1.细胞品系和培养条件需严格调控；

人多能干细胞相对比较脆弱，细胞多能性和状态容易收到外部环境刺激和培养条件的影响。

2.常用的转染方法在人多能干细胞上的转染效率极低；

目前广泛应用的化学转染方法如Lipo3000、PEI法等均无法真正有效地实现在人多能干细胞中的有效转染。

3.人多能干细胞在单克隆培养上存在存活低以及多能性无法维持等问题；

a.目前的单克隆获取方法普遍依赖于脱离超净工作台的克隆挑取技术，存在污染风险；

b.人多能干细胞在进行单克隆形成时存在死亡率高、且极易存现多能性退出、自发分化以及遗传不稳定等问题。

针对上述干细胞基因编辑领域的技术挑战，大家无需担忧。小源早就做好了应对，针对相关难题进行了系统性梳理，并整理了详细的解决方案。更多技术细节与突破性进展，点击下方链接即可了解。

>>一文掌握如何运用iPS敲除细胞株搭建高分研究体系，超详细讲解

在干细胞研究中，如果要进行大规模和无偏向性的基因功能研究，就需要使用CRISPR筛选技术。在筛选流程上，干细胞体系与普遍所认知的文库筛选的整体流程是基本一致的，也是由“sgRNA设计与合成”、“文库载体构建与病毒包装”“文库Cell Pool构建”、“功能筛选”以及“数据分析”等模块组成。然而，在干细胞文库筛选体系的搭建上，同样由于其生理特性和培养体系的特殊性，也存在着以下的核心技术难点需要重点考虑：

1.感染细胞的选择；

不同种类的干细胞，对应着不同的研究体系和目的。而人多能干细胞（ESC/iPSC），具有长期增殖和维持能力，病毒感染相对于分化后的细胞更加容易，文库Cell Pool构建成功率高，是目前使用最多的类型，效果稳定，最为推荐；

2.细胞干性的维持；

干细胞文库构建的另一个关键要点，就是细胞干性的维持。人多能干细胞的文库Cell Pool的培养和编辑规模都非常大，要保证其文库Cell Pool的成功构建，除了在操作上的精细程度进一步提高之外，还需要使用到利用 可诱导表达（tet-on）系统调控Cas9 表达时序性的人多能干细胞系。可诱导表达系统的使用，不仅可以保证干细胞的文库Cell Pool构建过程中避免受到多能性相关基因被干预而造成的多能性推出问题，还能在不同阶段个性化控制文库筛选的启动，满足客户不同研究体系的需求，提高干细胞文库筛选的灵活度。

3.适用的分化方法；

a.在CRISPR筛选中，干细胞的分化体系是一个非常有效的功能筛选方式，但并非所有的分化方法都是适用于CRISPR筛选的。在分化方法上，推荐仅需要通过换液和整体传代的方式的分化方法，而一些可能因为人为或主观性操作造成局部细胞转移的，如挑克隆、不均匀的传代方式，均不适用于文库筛选，分析会造成比较大的误差。

图2. 人多能干细胞的CRISPR筛选体系搭建

不管是干细胞基因编辑后的下游研究，还是干细胞文库Cell Pool的功能筛选，干细胞的定向分化都是不可或缺的一环。然而，不同种类的分化方法和难度差异巨大，而且在体外的定向分化上，也存在以下几点共性问题：

1.效率与纯度相对较低；

2.功能成熟度不足；

3.信号通路调控复杂度高；

4.规模化与成本相对较高。

针对干细胞定向分化的技术难点与客户需求，源井生物已成功开发多样化干细胞定向分化平台：除了已有的干细胞培养体系、iPSC细胞系相关产品以及干细胞基因编辑的技术服务之外，还新推出 神经干细胞/前体细胞分化、前脑神经元分化 以及 心肌分化 等方面的技术服务，并新增 早期三胚层分化、定形内胚层分化 以及 心肌分化试剂盒 等三款定向分化相关产品，帮助客户轻松搭建 “基因编辑——定向分化”的一体化服务平台。

图3.源井生物“基因编辑——定向分化”干细胞一站式服务平台

图4.源井生物神经干细胞、心肌分化技术服务效果展示

图5.源井生物干细胞分化试剂盒产品展示

IPSC基因编辑服务

iPSC定向分化服务

EZ-Stem™定形内胚层诱导试剂盒YD-DE-001

EZ-Stem™早期三胚层诱导试剂盒YD-T-001

EZ-Stem™心肌分化试剂盒YD-CM-001

源井生物依托自主基因编辑与干细胞培养平台，旨在实现干细胞定向分化平台的多样化开发，致力于成为从基因设计到下游功能实验的一站式解决方案领导者。除了以上已推出产品，我们还有间充质干细胞分化、造血分化以及肝分化等方向的技术服务，欢迎咨询了解更多。