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CRISPR文库筛选遇上肿瘤代谢：为什么环境决定一切？

近年来，CRISPR文库筛选几乎已经成为癌症研究的“标配”技术。借助这一高效工具，科研人员能系统性地识别出维持癌细胞生存与增殖所必需的基因——即癌细胞的“核心依赖”。部分通过筛选发现的靶基因，甚至已推动一些新药物靶点进入临床实验，凸显了该技术在基础研究与转化医学中的巨大价值。

但是，一个常被大家忽视的关键问题是：大多数CRISPR文库筛选是在高度理想化的标准培养条件下完成的。在这样的体系里，葡萄糖浓度远高于正常生理水平，氨基酸供应充足且种类齐全，氧气更是接近饱和。与真实肿瘤组织中营养紧缺、缺氧和代谢压力并存的状态相比而言，这种条件堪称“五星级酒店”——而肿瘤细胞在体内所面临的，则更像是“荒野求生”。

结果是，这类标准化条件虽为大规模高通量研究提供了便利，但无法真实反映肿瘤的病理生理环境，并且可能掩盖很多只在应激或资源匮乏情况下才出现的基因功能。换句话说，我们所依赖的筛选结果，可能仅仅揭示了癌细胞在“优渥条件”下的生存策略，而没能找到在临床相关环境中的关键基因。

图1. 通过CRISPR筛选研究的代谢环境

那么问题来了：在这种偏离真实环境的条件下，CRISPR文库筛选结果还能说明癌细胞在体内真正依赖什么吗？为了探讨代谢环境对筛选结果的影响，Johannes Zuber和Wilhelm Palm在Nature Reviews Cancer上发表题为“Modelling and deciphering tumour metabolism in CRISPR screens”的评论文章。文章的发表将有助于提高聚焦于CRISPR文库筛选的科研工作者对环境条件的关注度，重视环境对筛选结果的影响。

1.代谢条件如何改变筛选结果？

为了探讨不同培养环境对筛选结果的影响，作者通过设置不同的实验室环境模拟肿瘤的代谢情况，随后梳理不同环境下的研究结果得到了明确答案：代谢环境深度塑造了癌细胞的基因依赖性。

研究者构建了葡萄糖、氧气、氨基酸等单一变量培养条件下的细胞模型，以研究环境变量对癌细胞基因依赖性的影响。结果显示，当缺乏葡萄糖时，癌细胞被迫依赖线粒体氧化磷酸化（OXPHOS）来维持能量供应；而在高糖培养基中，同样的细胞通过糖酵解就能存活，并不会表现出对 OXPHOS的依赖，而在氧受限的细胞模型中，OXPHOS不再是关键生存途径，脂质代谢通路反而成为了维持细胞生长与生存的必需机制。除此之外，研究者还降低氨基酸供应，部分肿瘤细胞转向“摄取外源蛋白”作为氮源和碳源，依赖溶酶体对胞外蛋白进行分解回收。其中，LYSET被鉴定为关键的转运因子。为了更接近体内肿瘤环境，研究者还使用接近体内营养水平的培养基，筛选揭示了一批在标准高营养条件下完全“隐形”的依赖基因，显示了更强的病理相关性。

由以上结果得出的结论已经很清晰：癌症的基因依赖性并不是一成不变的，而是会受到微环境强烈调控，甚至在某种意义上是被环境“雕刻”出来的。这一发现告诉我们：如果忽视代谢环境，就有可能错过最关键、最具临床价值的靶点。

2.应对策略：将“真实世界”带入 CRISPR 文库筛选过程

为了克服上面说的局限性，文章提出了两种互补的方案来更准确地识别癌症的依赖性。

第一种方案，在体外模拟肿瘤真实代谢环境：在体外环境中精准重现肿瘤的单一代谢特征，如葡萄糖缺乏、缺氧或高蛋白环境。例如，RNAi筛选显示在葡萄糖不足时，癌细胞转而依赖线粒体氧化磷酸化；另有发现在高蛋白培养基中鉴定出溶酶体转运因子 LYSET，帮助癌细胞利用蛋白质作为替代营养。

另一种方法是通过开发营养组分更接近体内环境的“生理性”培养基，通过CRISPR文库筛选能够揭示在标准培养条件下难以检测的条件性必需基因。

第二种方案，直接在动物体内做 CRISPR 筛选：直接在动物模型（如小鼠）皮下肿瘤中开展CRISPR文库筛选，使细胞处于复杂、多变的体内真实环境。例如有研究发现，血红素生物合成酶在体内对癌细胞存活是必需的，这一依赖性在体外筛选中却无法捕捉。

但是体内CRISPR文库筛选也存在局限性，具体体现在可供分析的细胞数量，难以覆盖全基因组规模文库，通常依赖聚焦性文库。同时，CRISPR文库构建和移植前的预筛选过程也可能影响最终结果。

3.未来怎么做？

文章指出，CRISPR文库筛选的未来发展将依赖于持续的技术革新，以更贴近肿瘤的真实复杂性，未来可以通过以下几个方面改进：

小型高效文库：随着sgRNA设计优化，文库规模可进一步缩减，做更小、更精准的 CRISPR 筛选库。这不仅提升了体内筛选的可行性，也便于在更复杂的情境下进行多维度筛选，如结合代谢扰动、不同细胞系和药物处理条件。

可诱导系统：指平时不激活基因编辑，等细胞到了动物体内再启动，避免前期培养步骤干扰结果。构建可诱导的CRISPR-Cas9 至关重要，可避免在不良代谢条件下提前筛除关键基因，从而更准确地解析基因功能。

更真实的建模：通过使用模拟生理培养基、血清/间质液培养基，以及类器官或共培养体系，更好地重现肿瘤微环境。

多维度整合：未来的筛选应能够并行捕捉肿瘤代谢的多重复杂性，例如同时考察葡萄糖与氧气受限的条件。

体外与体内互补：体外筛选凭借可控性和高通量优势，适用于大规模系统研究；体内筛选则能提供病理生理学相关性，用于验证体外发现的临床价值。

4.对科研与药物研发的启示

以科研角度分析，现有依赖性数据库（如DepMap）主要基于标准培养条件，往往低估“条件性依赖”基因。未来研究应将代谢环境作为关键变量，在不同营养、氧气或应激条件下重复筛选，更接近体内真实依赖性，有助于绘制更精准的功能图谱，揭示肿瘤的适应性与可塑性。

以药物研发角度分析，在非典型或压力环境下显现的基因依赖，可能揭示更接近临床情境的关键靶点：筛选药物靶点，深度分析肿瘤细胞的“生存底线”，揭示肿瘤细胞耐药的分子基础，为患者分型以及精准医疗的个性化用药提供参考。

代谢环境决定筛选结果，肿瘤细胞的代谢状态直接影响基因依赖性。标准培养基中的筛选结果可能只反映了“理想”条件，无法揭示真实微环境中的依赖关系。结合体外与体内筛选，可以做到优势互补：体外筛选更高效适合大规模研究，而体内筛选则更具生理相关性。二者应结合使用，才能构建全面可靠的基因依赖性图谱。未来筛选实验将向模拟真实肿瘤微环境的方向发展，例如使用代谢扰动、类器官或共培养模型，这将有助于发现更具临床转化潜力的药物靶点。

对我们科研工作者而言，这是一个重要提醒：在解读任何CRISPR筛选结果之前，必须先追问一句——这些依赖性是在哪种环境条件下被定义的？只有回答了这一问题，结果才能被正确地放置在生物学和临床的语境之中。

准确的筛选结果离不开严谨的实验方案，高效的实验开展也需要得力的助手，源井生物全新推出CRISPR文库体内＋体外筛选，从体外环境模拟到体内真实“战场”，全维度覆盖，关键靶基因“无处可逃”。搭配自主研发的iScreenAnlys™文库分析平台，可一键完成筛选数据分析。我们还可以根据您的需要为您提供定制化筛选服务，无论您是想要正向筛选还是负向筛选，或是需要独特的细胞培养环境，我们都可以做到灵活适配您的研究。

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Zuber J, Palm W. Modelling and deciphering tumour metabolism in CRISPR screens. Nat Rev Cancer. 2025 Jan;25(1):1-2. doi: 10.1038/s41568-024-00758-8. PMID: 39354071.

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