期刊： Advanced Science（IF=14.1）

细胞模型： 小细胞肺癌细胞 SBC-2

筛选工具： 人全基因组 CRISPR 激活文库

筛选策略： SBC-2 细胞稳定表达 dCas9-VP64，转染全基因组 sgRNA 激活文库，嘌呤霉素筛选后用 elesclomol-Cu（ES-Cu，40 nM）处理 72 h，收集存活细胞与未处理对照，测序对比 sgRNA 丰度，经 MAGeCK RRA 筛选抗铜死亡基因，锁定 VPS34 并开展机制验证。

前言

铜死亡由游离铜结合 TCA 循环硫辛酰化蛋白（如 DLAT）引发，是克服肿瘤耐药的潜在靶点，但肿瘤如何感知铜压力并逃逸铜死亡、及其与放疗抵抗的关联尚不清楚。细胞铜稳态依赖摄入转运体 SLC31A1 与外排转运体 ATP7A 的平衡。本研究通过全基因组 CRISPRa 筛选发现 VPS34 是铜死亡关键负调控因子；阐明 PRMT5 甲基化 VPS34 R174 位点、招募 USP10 去泛素化稳定 VPS34，进而通过促进 SLC31A1 降解和 ATP7A 质膜转位双重降低胞内铜；该轴在放疗下被激活，介导放疗抵抗，靶向可增敏放疗。

研究创新点

1. 理论创新：首次鉴定 VPS34 为铜死亡关键负调控因子，揭示其 "减摄入 + 促外排" 双重铜转运调控新机制；阐明 PRMT5-VPS34 R174 甲基化 - USP10 去泛素化稳定新通路；建立铜稳态失调与放疗抵抗的因果联系。
2. 技术创新：CRISPRa 激活筛选结合 DIA 蛋白质组学锁定效应分子；IP-MS 互作组与 CCLE 药敏数据交叉整合定位 PRMT5；质谱 + 位点特异性抗体 + R174K 突变三重验证甲基化位点；分子对接解析互作界面；体内抑制剂联合放疗验证。

研究路线

• 全基因组 CRISPRa 筛选鉴定 VPS34 等铜死亡抗性基因，验证自噬的保护作用；
• 解析 VPS34 通过 SLC31A1 降解与 ATP7A 膜转运双重机制维持铜稳态；
• IP-MS 与 CCLE 数据整合鉴定上游甲基转移酶 PRMT5，验证 VPS34 R174 对称二甲基化；
• 阐明 PRMT5 招募 USP10 抑制 K48 泛素化、稳定 VPS34 的分子机制；
• R174K 突变回补实验验证甲基化功能必需性，体内外验证 PRMT5-VPS34 轴介导放疗抵抗及靶向增敏。

主要结果

1. 全基因组 CRISPRa 筛选鉴定 VPS34 为铜死亡负调控因子

研究人员首先在经铜离子载体elesclomol-copper（ES-Cu）处理的细胞中进行了全基因组 CRISPR 激活（CRISPRa）筛选，并对筛选体系的可靠性进行验证。结果显示，验证筛选体系可靠，且铜外排因子（ATP7A、MT2A/B）富集为正向 hits，铜死亡效应因子（FDX1、DLAT）和 SLC31A1 为负向 hits，Top hits 富集自噬与内体膜转运通路。DIA 蛋白质组学锁定 VPS34 上调最显著，Western blot 证实 ES-Cu 剂量依赖性上调 VPS34，FYVE 探针显示 PI3P 产物增多。VPS34 过表达抵抗铜死亡，敲除则增敏并加剧 DLAT 寡聚化（可被 FDX1 敲低逆转）。

图1.全基因组CRISPRa筛选鉴定出VPS34是铜诱导细胞死亡的负调控因子

2. VPS34 通过协调 SLC31A1 降解与 ATP7A 转运维持铜稳态

VPS34 过表达显著降低胞内铜水平（流式 CS1 探针及共聚焦成像），敲除则导致铜大量蓄积。机制上，VPS34 过表达不改变 ATP7A 总蛋白，但显著降低 SLC31A1 蛋白水平；溶酶体抑制剂 BafA1 可阻断该降解，证实 VPS34 通过溶酶体途径加速 SLC31A1 周转以减少铜摄入。对于 ATP7A，VPS34 过表达促使其显著转位至质膜；共定位分析显示 ATP7A 与 RAB7A（晚期内体）共定位增强，而与 EEA1（早期内体）、LAMP1（溶酶体）、LC3（自噬体）无明显重叠，表明 VPS34 通过 RAB7A 阳性内体分选途径将 ATP7A 循环至质膜、绕过降解区室，从而增强铜外排。

图2.VPS34通过协调SLC31A1的降解与ATP7A的转运，维持细胞内铜稳态

3. PRMT5 与 VPS34 互作并介导其 R174 位点对称二甲基化

随后，研究人员通过VPS34 互作蛋白（IP-MS 694 个）与 CCLE elesclomol 敏感相关蛋白取交集锁定 PRMT5，而ES-Cu 剂量依赖性上调 PRMT5。Co-IP 证实二者互作，定位于 VPS34 C2 结构域。SDMA 抗体显示 VPS34 存在对称二甲基化，PRMT5 正调控该修饰。质谱鉴定 R174 为甲基化位点（脊椎动物保守），R174K 突变体修饰降低。位点特异性抗体和分子对接（R174 嵌入 PRMT5 活性中心，SAM - 胍基距约 5 Å）进一步验证。

图3.PRMT5可催化VPS34在R174位点的 SDMA 修饰

4. PRMT5 通过招募 USP10 抑制 K48 连接多聚泛素化以稳定 VPS34

研究人员发现PRMT5 上调 VPS34 蛋白但不影响 mRNA，提示翻译后调控。MG132（非 BafA1）延长 VPS34 半衰期，CHX 追踪证实 PRMT5 过表达延长、敲低 / R174K 加速降解。VPS34 主要发生 K48 连接多聚泛素化，PRMT5 过表达抑制、R174K 高泛素化。7 个结合去泛素化酶中 siRNA 筛选锁定 USP10，Co-IP 证实互作且 PRMT5 增强结合。即 R174 甲基化招募 USP10 去泛素化稳定 VPS34。

图4.SDMA 在VPS34中可阻断VPS34的降解并促进自噬

5. R174 甲基化对 VPS34 稳定性和细胞抗铜死亡至关重要

PRMT5 过表达降低胞内铜、上调 SLC31A1 溶酶体降解、促进 ATP7A 质膜转位及 RAB7A 共定位，功能上增强铜死亡抗性；PRMT5 敲除则相反，加剧 DLAT 寡聚化（可被 FDX1 敲低逆转）。皮下移植瘤中 shPRMT5 组肿瘤生长和瘤重显著低于对照。遗传回补实验：VPS34-KO 细胞中回补 WT-VPS34 可恢复铜外排能力并抵抗铜死亡，而 R174K 突变体蛋白不稳定、无法降低胞内铜蓄积，也不能挽救铜死亡敏感表型，证实 R174 甲基化是 VPS34 发挥功能的必要条件。

图5.R174 甲基化对 VPS34 稳定性和细胞抗铜死亡至关重要

6. PRMT5-VPS34 轴促进放疗抵抗，靶向该轴可增敏放疗

研究人员发现放疗剂量依赖性升高胞内铜（ICP-MS），ES-Cu 增敏放疗、TTM 螯合铜则保护。放疗同时上调 PRMT5/VPS34 及 R174 二甲基化。克隆形成实验发现，过表达降低放疗敏感性，敲除增敏，R174K 无法回补。体内实验证实，VPS34 或 PRMT5 抑制剂联合放疗显著抑瘤。临床上，PRMT5/VPS34 高表达与肺癌不良生存相关，TCGA 显示 PRMT5 高表达患者放疗应答更差。

图6.PRMT5-VPS34轴有助于放射抗性

文章小结

本研究揭示 PRMT5-VPS34 轴是肿瘤铜死亡逃逸与放疗抵抗的核心通路：放疗 / 铜压力会上调 PRMT5，后者甲基化 VPS34 R174 位点并招募 USP10 去泛素化稳定 VPS34；VPS34 通过 PI3P 同时驱动 SLC31A1 溶酶体降解和 ATP7A 质膜转位，双重降铜以限制铜死亡和放疗疗效。靶向 PRMT5/VPS34 可释放铜毒性增敏放疗，PRMT5 抑制剂已有临床基础，转化前景良好。研究局限在于机制主要基于小细胞肺癌模型（SBC-2 为主），在 ATP7B 主导的肝等组织中的普适性待验证；放疗上调 PRMT5 的上游感知机制（如 ROS - 转录因子轴）尚未完全阐明。

源井生物EZ-iScreen™文库

源井生物自主研发 EZ-iScreen™ 技术平台，旨在实现高效的CRISPR筛选。源井生物拥有超过40种的CRISPR文库质粒现货供应，覆盖人类、小鼠、绿猴及猪等物种的全基因组基因敲除/抑制/激活文库；此外，还有针对激酶、细胞周期、膜蛋白、代谢等相关基因构建的CRISPR敲除/抑制/激活亚文库，助您轻松实现靶点筛选！更提供150+文库病毒现货，1000+文库Cell Pool产品及一站式CRISPR文库筛选服务，支持体内外功能筛选、NGS测序与数据分析。筛选模型覆盖肿瘤细胞、永生化细胞、免疫细胞（T细胞、NK细胞）、人多能干细胞 iPSC 等，助力药物靶点发现、疾病机制研究及功能基因组学探索。