CRISPR筛选引领突破：通过靶向 KHSRP恢复 SLC23A1 的功能可有效治疗抵抗性白血病

期刊：Blood Cancer Discovery IF=12.2

研究工具：CAL-1 细胞系、AML 细胞系（SIG-M5、MOLM-13、EOL-1、OCI-AML3）、患者来源异种移植（PDX）模型、原代 AML 患者样本。

文库类型：全基因组 CRISPR 干扰（CRISPRi）文库。

筛选策略：在 CAL-1 细胞中转导全基因组 CRISPRi 文库后，分别给予 Venetoclax + Azacitidine（VEN/AZA）或 Tagraxofusp 处理 3 天，分离早期治疗耐受残留细胞，通过 sgRNA 富集/缺失分析筛选影响药物敏感性和残留细胞存活的关键基因。

引言

急性髓系白血病（AML）容易因治疗过程中残留的癌细胞而复发。近日，Dana-Farber 癌症研究所 Andrew A. Lane 团队在 Blood Cancer Discovery 发表研究，通过全基因组 CRISPRi 筛选发现 KHSRP 是清除治疗耐受残留 AML 细胞的最有效靶点。KHSRP 缺失可恢复维生素 C 和尿酸双转运体 SLC23A1 的表达，增强维生素 C 和尿酸协同细胞毒性，选择性清除残留白血病细胞，为清除 AML 残留病灶提供了新策略。

研究背景

AML 治疗面临的核心挑战是治疗耐受残留细胞驱动的耐药与复发。白血病干细胞（LSCs）是 AML 起始、维持、化疗耐药和复发的重要驱动因素，Venetoclax 和 Tagraxofusp 等靶向药物可部分靶向 LSCs，但残留病灶率仍高。维生素 C 作为 TET 甲基胞嘧啶双加氧酶辅因子，可增强 5mC 向 5hmC 转化，促进 DNA 去甲基化，被认为具有抗 AML 作用；尿酸与维生素 C 具有相似的氧化还原双重角色，且二者共享膜转运体。然而，AML 细胞内在的尿酸功能及其与维生素 C 依赖性生物学的联系尚未被研究。

研究目的

1. 明确治疗耐受残留白血病细胞区别于初诊和复发阶段的独特生物学特征；
2. 通过全基因组 CRISPRi 筛选鉴定可选择性清除残留白血病细胞的靶点；
3. 阐明 KHSRP 调控 SLC23A1 表达及残留细胞存活的分子机制；
4. 验证维生素 C 和尿酸对残留白血病细胞的选择性细胞毒性及 TET2 依赖性；
5. 评估靶向 KHSRP 在体内延长 AML 治疗生存的转化潜力。

研究方法

1. 细胞模型：CAL-1细胞；SIG-M5、MOLM-13、EOL-1、OCI-AML3 等 AML 细胞系；TET2 缺失突变AML 细胞，TET2 回补AML 细胞；KHSRP 敲低、SLC23A1 敲低、ZC3H4/ZC3H18 敲低及 KHSRP 截断体表达细胞。
2. 动物模型：NSG 小鼠尾静脉注射 AML 细胞系或 PDX 细胞，模拟初诊、治疗耐受残留和复发阶段；Venetoclax/Azacitidine体内治疗，评估生存和残留病灶。
3. CRISPR 筛选：CAL-1 细胞转导全基因组 Dolcetto CRISPRi 文库，分别采用 Venetoclax 联合 Azacitidine（VEN/AZA）或 Tagraxofusp 处理细胞，富集活细胞，NGS 分析 sgRNA 富集/缺失；
4. 机制验证：RT-qPCR、Western blot、免疫荧光、免疫共沉淀、eCLIP-seq、RNA-seq、DNA dot blot（5mC/5hmC）、Caspase-Glo 3/7 活性检测；
5. 临床与转化研究：6 例 AML 患者样本，包括治疗前、残留和复发阶段；4 例接受 Venetoclax/去甲基化药物治疗的患者骨髓样本，分析 SLC23A1 表达与疗效关系。

主要结果

1. KHSRP 对白血病细胞治疗后的存活至关重要

KHSRP 缺失在多个 AML 细胞模型中验证可减少治疗后存活细胞，并增强 Venetoclax 与 Azacitidine 的协同效应，而在无治疗时对细胞生长无明显影响，提示其作为选择性清除残留细胞的靶点具有治疗窗口。

图1. 全基因组 CRISPRi 筛选确定 KHSRP 是消除耐治疗白血病细胞的首选靶点

2. KHSRP缺失会增加SLC23A1的表达，从而减少白血病残留病灶

在多个 AML PDX 模型、原代患者样本及接受 Venetoclax/去甲基化药物治疗的患者骨髓样本中，均验证了 SLC23A1 在残留病灶中的特异性下调，KHSRP 敲低可上调 SLC23A1 表达。在治疗后残留白血病病灶中，KHSRP 缺失介导 SLC23A1 表达恢复，进而促使残余白血病细胞发生耗竭。

图2. KHSRP缺失会增加SLC23A1的表达，从而消耗残留的白血病细胞

3. KHSRP通过招募ZC3H4促进SLC23A1 mRNA降解

eCLIP-seq 未发现 KHSRP 与 SLC23A1 mRNA 直接结合，且 KHSRP 缺失未引起显著剪接改变。CRISPRi 筛选发现 ZC3H4同样是相关靶基因。免疫共沉淀证实 KHSRP 与 ZC3H4 直接相互作用；敲低 KHSRP 或 ZC3H4 均增加 SLC23A1 mRNA表达，而敲低 ZC3H18 无此效应。KHSRP 与 ZC3H4 作用于同一通路；删除 KHSRP 蛋白互作结构域可消除其对 SLC23A1 表达和残留细胞清除的影响。

图3. KHSRP与ZC3H4相互作用并促进SLC23A1 mRNA降解

4. 尿酸和维生素C对残留的白血病细胞有选择性毒性

KHSRP 缺失使细胞内维生素 C 和尿酸摄取增加 2–5 倍，敲低 SLC23A1 可逆转。尿酸和维生素 C 均促进 5mC 向 5hmC 转化；在 TET2 突变 AML 细胞中重新表达 TET2 可逆转 KHSRP 缺失对残留细胞的清除增强及 5hmC 转化增加，支持 TET 依赖性机制。

图4. 尿酸和维生素C对残留白血病细胞有协同毒性，并促进5mC向5hmC的转化

小源总结

本研究通过全基因组 CRISPRi 筛选和PDX 转录组分析，发现 KHSRP 是清除 AML 治疗耐受残留细胞的最有效靶点。残留白血病细胞下调 SLC23A1 以抵抗维生素 C 和尿酸介导的细胞毒性；KHSRP 通过招募 ZC3H4 促进 SLC23A1 mRNA 降解，维持 SLC23A1 低表达。KHSRP 缺失可恢复 SLC23A1 表达，增强维生素 C 和尿酸协同细胞毒性，选择性清除残留白血病细胞。该研究不仅揭示了 KHSRP-ZC3H4-SLC23A1 三者在 AML 残留病灶中的协同作用，还提出了靶向 KHSRP清除AML残留病灶的新型治疗策略。

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