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CRISPR文库干货

Expert Insights - CRISPR Library

如何在衰老研究模型中活用CRISPR筛选文库——揭秘衰老大脑的“重启密码”，神经干细胞再生有望实现

人体器官的功能会随着衰老而逐渐下降，我们的大脑也不例外。随着年龄的增长，往往也会伴随着感知能力与认知能力的衰退，出现神经退行性疾病的风险也会越来越高，其中以阿兹海默症和帕金森病最为常见。在我们的大脑中，存在着一些富含神经干细胞（NSC）的区域，比如目前研究较为广泛的脑室下区（SVZ）。这些NSC在脑部组织受到损伤后，能够从静息态（qNSC）转变为具有扩增能力的激活态（aNSC），并经过有序地分化和迁移后，为我们受损的大脑补充新生神经元。然而，当大脑开始衰老，神经干细胞的激活能力会显著降低，无法完成新生神经元的补充，进而导致我们感知和认知功能的缺失。

研究NSC激活的调控基因有助于我们在临床上干预并抑制衰老过程中的神经退行性缺陷。虽然目前有部分工作已经揭示了一些能够促进衰老NSC激活的重要因子，但在这方面的研究依然缺乏系统性的全面探索。此外，可进行大规模、高通量基因功能研究的CRISPR文库筛选技术也尚未在衰老细胞或机体中建立成熟、稳定的应用体系。

图1. 大脑区域与神经干细胞的激活和分化^[1]

2024年10月2日，斯坦福大学Anne Brunet团队在Nature杂志上在线发表题为“CRISPR–Cas9 screens reveal regulators of ageing in neural stem cells ”的研究论文^[2]。该研究针对衰老细胞和机体，开发了体外和体内的高通量CRISPR-Cas9筛选平台，系统地揭示能够促进老年小鼠NSCs激活的基因，并进行了全面的功能验证。

为了全面筛选出能够调控衰老NSC激活的基因，作者在年轻和老年小鼠中分离出原代NSC，并针对这些细胞开展CRISPR文库筛选。体外培养的NSC在特定生长因子的作用下能够完成qNSC和aNSC之间的转换，利用这一点，作者对NSC进行体外扩增后，通过慢病毒感染导入靶向约23000个编码基因的全基因组敲除文库，实现超过4亿个qNSCs的成功文库感染。随后，作者使用生长因子激活qNSC，并在第4天（通过流式分选富集成功激活的NSC）和第14天（通过成功激活的NSC的扩增优势富集细胞）收集细胞样品进行测序分析。通过评估sgRNA的富集和耗竭，作者筛选出301个基因的敲除能够特异性促进衰老NSC激活，这些基因与纤毛组织结构、RNA结合蛋白以及葡萄糖运输高度相关。

图2. 体外CRISPR筛选筛选寻找影响衰老NSC功能的调控因子

虽然体外体系能够在一定程度上模拟体内的衰老过程，但两者之间依然存在不少差异。为了检验在体外平台中筛选得到的这些在敲除后能够促进NSC激活的功能靶点，作者进一步开发了针对老年小鼠大脑的CRISPR文库筛选平台。SVZ区域的qNSC能够在体内激活并产生子代，这些子代细胞会迁移至嗅球区域并分化为新生神经元，这个再生区域的天然特性为体内筛选提供了良好的模型。作者向老年小鼠的侧脑室注射sgRNA文库病毒，感染SVZ区域的NSC，并对感染5周后嗅球区域组织的基因组DNA进行测序分析。基于体外筛选的结果，在体内平台中作者分别评估了5个不同的文库（每个文库靶向10个基因），分别包括：

• · 体外筛选中敲除后会促进衰老神经元激活的“Top 10”基因；
• · 葡萄糖摄取与人类疾病相关文库；
• · 细胞质核糖核蛋白结构相关文库；
• · 体外筛选中敲除后会抑制衰老神经元激活的代表性基因；
• · 已知的NSC功能激活因子，最终有24个基因在嗅球组织中显著富集。

其中，葡萄糖摄取与人类疾病相关文库的10个基因中有9 个在至少一次体内筛选中达到显著性。

图3. 老龄小鼠大脑中的体内CRISPR/Cas9 筛选

在体外和体内筛选中，Slc2a4基因（编码葡萄糖转运蛋白GLUT4）的敲除始终能够显著增强衰老NSC活性和功能。以往的研究曾报道葡萄糖代谢与年轻NSC的自我更新、存活和分化等过程有关，但其在衰老NSC和机体中的功能尚未被揭示。基于这一点，作者对Slc2a4进行下游的功能验证。研究发现，Slc2a4的敲除会导致感染5周后嗅球中新生神经元的数量显著增加。此外，Slc2a4的敲除后，SVZ区域的神经干细胞（qNSC和aNSC）数量也会有所增加，而且GLUT4在NSC中的表达会随着年龄的增大而增加。

图4. Slc2a4基因敲除的功能验证

基于以上的功能验证，作者提出一种假设：GLUT4的年龄依赖性增加可能会严重抑制衰老大脑的NSC活性和功能。GLUT4属于胰岛素依赖型转运蛋白，可以增加细胞的葡萄糖摄取。除了基因调控上的验证外，作者还测试了通过限制葡萄糖的摄取是否能够成功调节衰老NSC的活性或功能。研究表明，无论是通过短暂的葡萄糖饥饿还是使用葡萄糖类似物进行干扰，这些外源性限制葡萄糖摄取的手段都能有效激活衰老NSC。因此，降低NSC中的葡萄糖摄取有潜力成为促进衰老NSC恢复活性和再生能力的有效手段。

图5. 葡萄糖摄取对衰老神经干细胞功能的影响

在本研究中，作者开发了体外和体内高通量CRISPR-Cas9筛选平台，系统地揭示能够促进衰老NSC活化和神经元再生能力的调节因子。在年轻和衰老NSC的原代培养物中进行的体外全基因组筛选中，作者发现了301个在敲除后能够特异性增加衰老NSC激活的基因。这些基因涉及纤毛组织和葡萄糖摄取等生物学过程。此外，作者还建立了一个可扩展的体内CRISPR-Cas9筛选平台，确定了24个能够促进老年大脑中NSC激活和功能的基因敲除。值得注意的是，敲除Slc2a4（编码GLUT4葡萄糖转运蛋白）被证明是改善衰老NSC功能的有效干预措施。随着年龄的增长，NSC中的葡萄糖摄取量有所增加，而限制葡萄糖的摄取可以促进衰老NSC的激活能力。这些发现不仅增进了我们对NSC衰老机制的理解，也为开发针对衰老相关神经退行性疾病的新疗法提供了潜在的新型策略。

本文CRISPR筛选亮点

1. 1. 体外大规模筛选平台与可扩展的体内平台的联合验证；
2. 2. 超大规模与高覆盖度的全基因组敲除筛选；
3. 3. 设置激活第4天（FACS富集）与第14天（增殖富集）的双时间点分析；
4. 4. 对年轻与衰老NSC进行同步筛选，探寻特异性调控衰老NSC活化的功能靶点。
5. 5. 体外NSC活化与体内的天然再生特性提供有效的功能筛选体系。

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CRISPR文库筛选技术的引入，正在为衰老研究与神经干细胞再生提供全新的视角与工具。通过大规模功能基因筛选，我们不仅能够系统识别衰老的关键调控因子，还能够在机体水平验证真实的干预效果。随着平台和技术的不断成熟，未来有望通过靶向代谢、纤毛功能、RNA调控等关键路径，实现衰老大脑的“重启”，为延缓认知衰退和神经退行性疾病治疗开辟新道路。

参考文献

• · Navarro Negredo P, Yeo RW, Brunet A. Aging and Rejuvenation of Neural Stem Cells and Their Niches. Cell Stem Cell. 2020 Aug 6;27(2):202-223.
• · Ruetz TJ, Pogson AN, Kashiwagi CM, Gagnon SD, Morton B, Sun ED, Na J, Yeo RW, Leeman DS, Morgens DW, Tsui CK, Li A, Bassik MC, Brunet A. CRISPR-Cas9 screens reveal regulators of ageing in neural stem cells. Nature. 2024 Oct;634(8036):1150-1159.