干货丨786-0细胞培养和基因编辑Tips
人肾透明细胞腺癌细胞(786-0)源自一个58岁白人男性原发性透明细胞癌。细胞同时具有微绒毛和桥粒，可在软琼脂中生长。这些细胞产生一种类似于肽的PTH，与乳腺和肺肿瘤产生的肽相同。该肽具有与PTH类似的N末端序列，具有PTH样活性，分子量为6000道尔顿。据报道，该细胞可在免疫抑制仓鼠体内成瘤。小源现在就奉上786-0细胞独家培养秘籍，带大家一次性解锁786-0细胞的培养技巧与基因编辑实操要点！
一、人肾透明细胞腺癌细胞(786-0)基本信息
- 细胞名称： 人肾透明细胞腺癌细胞(786-0)
- 细胞形态： 上皮样细胞，贴壁生长
- 细胞培养条件： 90%RPMI -1640+10%FBS
- 气相： 空气，95%；二氧化碳，5%
- 温度： 37℃
- 换液频次： 2-3天/次
- 传代比例: 1:2-1:4
细胞生长状态参考：
正常状态： 呈现为贴壁生长的上皮细胞样形态，多角形或不规则形状，胞质丰富且可能含空泡。（见下图）
异常状态： 异常状态：细胞轮廓模糊，细胞可能由梭形或多边形变为圆形、椭圆形或不规则形状；细胞体积缩小或变大等。（见下图）
二、786-0细胞复苏流程
- 准备培养基 取7mL完全培养基于离心管中备用。
- 细胞解冻 将细胞从干冰里取出，用镊子夹住盖子放入 37℃水浴中快速晃动（注意：水不能没过盖子），使其在1分钟左右完全融化，直至冰块融化至绿豆大小，停止水浴。
- 细胞离心 将解冻后的细胞悬液转移至离心管中，1100rpm条件下离心4分钟，弃去上清液。
- 重悬与接种 用完全培养基重悬细胞，接种于合适大小的培养皿或培养瓶中。
- 细胞培养 将培养皿或培养瓶置于37℃培养箱中培养，24小时后观察细胞状态及贴壁情况。
三、786-0细胞传代步骤（以T25瓶为例）
-
传代条件
当细胞汇合度达到80-90%时可进行传代。
传代时在超净台内弃去培养瓶里的培养液，加入5mLPBS洗涤细胞1-2次。 -
胰酶消化
加入1mL胰酶，轻轻晃动瓶子并使胰酶完全浸过细胞。
将培养瓶放入培养箱孵育 1-2分钟。
待在显微镜下观察到大部分细胞变圆变亮，轻轻晃动培养瓶两侧有大部分细胞脱落时，立即终止消化。 -
终止消化
加入2倍胰酶体积即2mL完全培养基终止消化。
然后转移至15mL离心管中。 -
细胞悬液离心
1100rpm室温离心4分钟。
离心结束，弃去上清，加入完全培养基重悬细胞。 -
传代培养
细胞按照1:2-1:4比例传代。首次传代建议1:2比例进行传代。
传代第二天观察细胞状态。
四、786-0细胞冻存步骤
-
收集细胞
按照细胞传代的过程收集消化好的细胞到离心管中。 -
离心
1100rpm条件下离心4分钟，去掉上清。 -
重悬与冻存
用细胞冻存液重悬细胞，按每1mL冻存液含1×10^6个细胞/mL分配到冻存管中，标注好名称、代数、日期等信息。 -
降温与储存
将冻存管置于程序降温盒中，-80℃冰箱中过夜后转入液氮罐内保存。
五、786-0细胞培养注意事项
-
细胞状态： 细胞生长至80-90%汇合度时传代最佳；对于生长中的细胞，每2-3天更换一次新鲜完全培养基。
-
培养基保存： 确保培养基储存于4°C避光，并在有效期内使用。
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培养环境： 严格遵守基础培养条件，确保细胞培养环境正常；使用正确的培养体系。
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操作细节： 操作前需预热培养基和胰酶至37℃，避免温度应激。
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选用高质量血清： 建议使用优质胎牛血清进行培养。
六、786-0细胞转染时注意事项
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细胞状态要求
- 确保细胞状态良好，使用处对数生长期即 汇合度在70-80% 的细胞。
- 细胞活率＞90%，可通过台盼蓝进行检测。
- 使用 低代次细胞。
- 注意细胞消化时间， 避免过度消化 ，对细胞造成伤害。
- 实验过程中细胞要吹打成单细胞，避免细胞聚团。
-
转染试剂与预实验
- 转染试剂使用前需要充分混匀保证其均匀性。
- 建议进行药筛预实验找到 最佳药筛浓度 ，以便于转染后进行药筛。
-
电转法
- 控制细胞量，电转后根据细胞量接种至合适的培养板里。
- 使用温和的胰酶，并用含血清的培养基彻底终止消化。
- 用PBS洗涤细胞1-2次，彻底去除残留血清，避免离子干扰电穿孔。
- 进行预实验对电转参数进行优化。
- 保证电转后细胞贴壁率≥60%。
- 控制实验时间，电转全程不宜过长。
-
慢病毒法
- 进行预实验找到最合适的MOI。
- 转染前18-24h铺板，感染病毒前细胞汇合度控制在30-40%之间，不可过高。
- 感染前添加助染剂Polybrene。
- 感染后24h进行换液。
- 感染使用的病毒液避免反复冻融。
- 若感染效率过低可进行复感染（需确保细胞对病毒耐受性良好）或尝试使用离心法感染。
七、786-0细胞铺单克隆实验注意事项
-
细胞状态要求
- 使用对数生长期的细胞进行铺克隆，铺克隆前细胞汇合度建议控制在70%左右。
- 铺克隆时细胞活率≥90%。
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试剂与预实验
- 提前预温所有试剂（包括培养基、PBS）。
- 建议使用温和消化试剂（如TrypLE Express）。
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铺板策略
- 进行预实验找到合适的铺克隆梯度，避免单克隆占比太低。
- 细胞接种96孔板时需确保细胞分布均匀；外围96孔加入PBS防止蒸发。
-
稀释方法
- 使用“极限稀释法”进行铺克隆。
- 稀释细胞计数后结果最好落在1*10^6-2*10^6之间。
慢病毒感染后细胞图
单克隆细胞图
八、786-0细胞培养常见问题及解决方案
1. 细胞生长缓慢、增殖差怎么办？
表现： 细胞传代后经过相同时间的培养（如48小时或72小时），汇合度明显偏低；部分细胞可能出现皱缩、漂浮或形态。
-
可能原因：
- 传代时接种密度过低或传代比例过高。
- 培养条件不正确。
-
解决方法：
- 细胞密度达80%-90% 时进行传代，首次传代建议1:2比例，建议传代比列控制在1：2-1：4之间。
- 确认使用正确的培养基RPMI-1640 + 10%胎牛血清。
- 确认CO₂培养箱条件为37°C, 5% CO₂。
2. 细胞形态异常怎么办？
表现： 多边形上皮形态消失，空泡变多、细胞边缘模糊、拉丝、漂浮一些细胞碎片
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可能原因：
- 消化过度或者吹打力度过猛。
- pH 过酸/过碱、渗透压异常。
- 支原体污染。
- 血清批次差、内毒素高（786-O对血清较为敏感）。
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解决方法：
- 适当控制消化时间，细胞间隙拉开、镜下变圆即终止，轻柔吹打（10 次内）。
- 维持pH在 7.2–7.4之间，必要时加可以添加HEPES溶液。
- 血清：用低内毒素、批次稳定的。
- 可以每隔48h进行换液，去除代谢废物。
3. 细胞转染效率低下怎么办？
表现： 荧光阳性率低、药物处理后效果差。
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可能原因：
- 转染方法选择错误。
- 转染时细胞状态差。
- 转染参数不进行优化。
-
解决方法：
- 当转染效率持续低于40%时应考虑从脂质体转染转向慢病毒转导转染或者电转法。
- 确保转染前细胞状态正常，细胞处于对数生长期，细胞支原体为阴性。
- 根据所选的转染方法选择合适的接种密度，不可过稀或过密。
- 优化转染参数，比如对核酸浓度、试剂比例进行梯度预实验。
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