技术前沿 | CAR 适配性 PIK3CD 碱基编辑：精准调控 PI3Kδ 增强 CAR-T 疗效

引言

CAR-T 细胞疗法在血液肿瘤疗效显著，但 体内持久性不足、易耗竭、实体瘤效果差 是核心瓶颈，不同共刺激结构域（4-1BBz/28z）的 CAR-T 信号强度差异导致功能分化迥异。德国图宾根大学 Judith Feucht 与 Josef Leibold 团队在《Nature Cancer》发表研究，建立ROADSTAR精准编辑筛选平台，针对 PIK3CD 开展 CAR 适配型碱基编辑筛选，发现E81K（激活 PI3Kδ）与L32P（减弱 PI3Kδ）分别特异性增强 4-1BBz 与 28z CAR-T 的抗肿瘤效力，为下一代定制化 CAR-T 提供全新策略。

研究背景

CAR-T 胞内共刺激结构域（CD28/4-1BB）决定细胞代谢、命运与功能：28z 型增殖快、效应强但易耗竭、持久性差；4-1BBz 型持久性好、记忆性强但效应与增殖偏弱。PI3Kδ 是 T 细胞信号、代谢与命运的核心调控分子，其信号强度与 CAR-T 功能密切相关。传统基因敲除 / 过表达无法精准校准信号强度，且未考虑不同 CAR 骨架的适配性，极大限制疗效提升。

研究目的

建立CAR 适配型碱基编辑筛选体系（ROADSTAR），鉴定 PIK3CD 的功能性点突变，实现 4-1BBz 与 28z CAR-T 的信号精准微调， 分别增强其持久性、效应功能与抗肿瘤能力。

研究方法

• 碱基编辑筛选
  • 构建靶向 PIK3CD 衔接结合域（ABD）的 sgRNA 文库，在 19BBz/1928z CAR-T 中进行 ABE/CBE 碱基编辑筛选。
  • 重复肿瘤抗原刺激压力筛选，NGS 测序鉴定富集突变。
• 细胞功能验证
  • 流式检测 p-AKT、活化、表型、耗竭、代谢、细胞毒与增殖。
  • 3D 胶原迁移与活细胞成像观测杀伤与迁移效率。
• 动物实验

  Nalm6 白血病、Sh-Sy5y 神经母细胞瘤体内模型评估疗效与安全性。

• 多组学分析

  单细胞转录组、代谢组、Seahorse 代谢通量分析机制。

研究路线

• 富集筛选： 建立 ROADSTAR 平台，筛选出 4-1BBz 富集E81K、28z 富集L32P。
• 信号验证： E81K 活化 PI3Kδ，L32P 减弱 PI3Kδ，呈现 CAR 依赖的双向调控。
• BBz 优化： E81K 增强 4-1BBz 增殖、效应、代谢适应性与长期持久性，抵抗耗竭。
• 28z 优化： L32P 降低 28z 信号强度，促进记忆形成，提升持久性与实体瘤疗效。
• 机制解析： 代谢重编程、记忆 / 效应表型重塑、FOXO3 通路下调。
• 转化验证： 安全无致瘤性，适用于多靶点、多肿瘤，临床转化潜力高。

主要结果

1. PI3Kδ 碱基编辑筛选鉴定 CAR 特异性功能性点突变

不同 CAR-T 细胞存在天然 PI3K 信号差异，28z 型信号强、4-1BBz 型信号弱，研究通过 ROADSTAR 筛选平台在 PIK3CD 上鉴定出 CAR 特异性突变，E81K 可激活 PI3Kδ 并富集于 4-1BBz CAR-T，L32P 可减弱 PI3Kδ 并富集于 28z CAR-T，两种突变均通过改变蛋白结构精准调控信号强度。

图1.对1928z和19BBz CAR T细胞中 PI3Kδ 的ABD区域进行碱基编辑的筛选结果表明，某些点突变具有有益效应。

2 .E81K 增强 4-1BBz CAR-T 的抗肿瘤功效

E81K 编辑可提升 4-1BBz CAR-T 的活化水平与效应记忆表型，增强增殖与杀伤能力，在白血病模型中实现更优的肿瘤控制与更长生存期，同时促进体内扩增并降低耗竭表型，效应记忆 T 细胞是主要功能亚群。

图2.E81K通过增强19BBz CAR T细胞的活化能力及效应记忆表型，同时防止细胞耗竭，从而在体内提升其抗肿瘤疗效。

3. E81K 赋予 BBz CAR-T 长期功能持久性并提升实体瘤疗效

E81K 赋予 4-1BBz CAR-T 长期抗肿瘤持久性，可抵御肿瘤再挑战而不复发，在实体瘤模型中显著抑制肿瘤并延长生存，提高瘤内 CAR-T 比例与效应记忆细胞占比，有效突破实体瘤疗效瓶颈。

图3.E81K基因编辑可维持BBz CAR T细胞的功能持续性，并在体内改善肿瘤控制效果。

4 .E81K 通过代谢重编程增强 BBz CAR-T 功能适应性

E81K 通过代谢重编程优化 4-1BBz CAR-T 功能，上调细胞毒性与高代谢亚群、减少耗竭亚群，增强糖酵解与线粒体呼吸能力，提升备用呼吸能力与 NADH 水平，从代谢层面增强细胞持续作战能力。

图4.在经过E81K编辑的19BBz CAR T细胞中，PI3K活性的增强与效应功能及代谢适应性的提升相关。

5. L32P 优化 28z CAR-T，促进记忆形成并增强实体瘤疗效

L32P 通过适度下调 PI3K 信号优化 28z CAR-T，降低过度活化、提升增殖并促进记忆表型形成，在保留高效杀伤的同时减少耗竭、提升持久性，显著增强 28z CAR-T 在实体瘤中的治疗效果。

图5.L32P替换通过增强记忆形成，提高了基于28z的CAR T细胞在体内的抗肿瘤疗效。

研究意义与创新点

• 首次提出 CAR 适配型精准碱基编辑（ROADSTAR） ，颠覆 “一刀切” 基因改造，实现 “一 CAR 一突变” 定制化优化。揭示 PI3Kδ 信号强度双向调控法则：激活→增强 4-1BBz；减弱→优化 28z。
• 同时解决两大主流 CAR-T 瓶颈：4-1BBz 效应不足、28z 易耗竭。碱基编辑安全、无致瘤性、可通用至多靶点，适合临床快速转化。阐明 CAR 骨架决定最优信号强度，完善 CAR-T 信号 - 代谢 - 命运调控网络。

文章小结

本研究创建 ROADSTAR 精准碱基编辑平台，针对 PIK3CD 筛选获得 CAR 特异性点突变： E81K 通过激活 PI3Kδ 增强 4-1BBz CAR-T 的效应、代谢与长期持久性；L32P 通过减弱 PI3Kδ 改善 28z CAR-T 的记忆形成与体内持久性。两种突变均显著提升血液与实体肿瘤疗效，且具备高度安全性。该研究建立了适配不同 CAR 骨架的个性化 T 细胞编辑新范式，为下一代高性能、长持久、强实体瘤疗效的 CAR-T 提供核心技术与靶点。

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