源井稳转细胞系助力揭示沙门菌劫持巨噬细胞穿越肠道血管屏障机制

源井稳转细胞系助力揭示沙门菌劫持巨噬细胞穿越肠道血管屏障机制

前言

沙门菌是一种重要的病原体，可导致人类和动物出现食源性中毒和伤寒等疾病。沙门菌通过受污染的食物摄入人体后，侵入小肠上皮细胞，随后传播至肝脾等器官。研究显示，沙门菌能在感染后15分钟内进入宿主的血液循环，其早期的血流感染被视为全身扩散的关键途径之一^[1]。尽管人类肠道的肠-血管屏障具有阻止病原细菌传播的作用，沙门菌却能迅速突破该屏障，传播到血液和肝脏等器官中^[2]。这一过程的机制至今仍不完全清楚。

摘要

近日，山东第一医科大学李冰清团队与陈启鑫团队合作在The EMBO Journal杂志上发表了题为“Salmonella manipulates macrophage migration to penetrate the gut-vascular barrier by SteC-mediated MLC activation”的文章，该研究采用了源井生物构建的过表达pSteC、pSteC K256H和GFP的RAW264.7细胞系，全文揭示沙门菌感染早期侵入血液的机制：沙门菌通过效应蛋白SteC磷酸化宿主肌球蛋白轻链（MLC, Myl12a），挟持巨噬细胞穿透肠道血管屏障，进而入血扩散。值得注意的是，SteC展现出与已知激酶不同的二聚体构象，并能利用四种核苷酸（ATP, UTP, GTP, CTP）催化蛋白磷酸化，使沙门菌在ATP耗竭的宿主环境中获得生存优势。

研究方法与结果

为探究沙门菌早期入血的机制，研究人员首先构建了GFP荧光标记的沙门菌动物感染模型。通过在感染后1小时内对小鼠肠道进行免疫荧光染色分析，发现沙门菌在感染后30分钟便大量聚集在血管周围的CX3CR1⁺的巨噬细胞中。进一步分析感染后小鼠血液中的细胞类型，结果显示GFP标记的沙门菌主要存在于CX3CR1⁺的巨噬细胞中。这表明沙门菌通过CX3CR1⁺的巨噬细胞突破血管屏障，进入血流进行感染。

研究人员发现，在沙门菌感染后，巨噬细胞的运动和侵袭能力显著增强。然而，经过脂多糖（LPS）处理或加热的沙门菌，并不具备提高巨噬细胞运动性的能力。进一步的研究揭示，沙门菌激活巨噬细胞的运动和侵袭能力依赖于Actin细胞骨架，而与Tubulin细胞骨架无关。通过构建与细胞骨架调控相关的沙门菌效应蛋白的敲除菌株，研究人员筛选出起关键调控作用的效应蛋白为SteC。研究人员利用BMDM和RAW264.7两种细胞类型，验证了沙门菌效应蛋白SteC对巨噬细胞运动和侵袭能力的调控。

SteC是沙门菌T3SS分泌系统分泌的唯一激酶效应蛋白，SteC与已知激酶同源性低，PDB中也没有类似SteC的蛋白结构。研究显示，在成纤维细胞中，SteC通过磷酸化MEK通路促使肌动蛋白重排，这一过程有助于沙门菌在宿主细胞内的生存^[3]。研究人员通过由源井构建的稳定表达pSteC、pSteC K256H和GFP的RAW264.7细胞系发现，巨噬细胞内MEK-ERK通路在沙门菌感染后呈抑制状态，因此SteC可能通过一种全新的途径来调控巨噬细胞的运动性。

图1 .SteC以不依赖MEK/MLCK的方式促进巨噬细胞迁移和侵袭以及肌动蛋白重排

为了寻找SteC在巨噬细胞中的作用靶点，研究人员构建了RAW264.7巨噬细胞系的cDNA文库，并使用SteC作为诱饵进行酵母双杂交筛选，最终确定肌球蛋白调控轻链（MLC, Myl12a）是SteC在宿主细胞中的主要作用靶点之一。进一步研究发现，SteC能在体内外催化Myl12a的Thr19和Ser20的磷酸化激活，这一过程不依赖宿主MEK-ERK-MLCK和ROCK等传统MLC激活通路。体内实验显示，沙门菌感染后15分钟，巨噬细胞中就会出现依赖SteC的Myl12a磷酸化现象。生化分析揭示，SteC是一种特殊激酶，可以利用ATP、UTP、CTP和GTP作为磷酸供体实现Myl12a的磷酸化。通过对SteC晶体结构的分析，发现了一种独特的二聚体介导的激酶活性中心构象，这与所有已报道的激酶结构均不相同。SteC通过其激酶结构域前的长螺旋结构模拟Myl12a底物，从而招募Myl12a蛋白。体内实验证明，敲除steC的沙门菌失去了驱动巨噬细胞穿透血管屏障以及引起多器官感染的扩散能力。

结论

综上所述，本文揭示了一种全新的病原菌劫持宿主细胞功能的机制：沙门菌通过分泌效应蛋白SteC到巨噬细胞中，磷酸化激活肌球蛋白轻链Myl12a，引发巨噬细胞肌动蛋白重排，操纵巨噬细胞运动侵袭性，进而将巨噬细胞作为“木马”，携带其进入血液系统，并随之播散到各靶器官造成多器官感染（图2）。

图2 沙门菌SteC调控巨噬细胞运动及体内扩散的机制模型

参考文献

【1】Vazquez-Torres, A., Jones-Carson, J., Bäumler, A. J., Falkow, S., Valdivia, R., Brown, W., ... & Fang, F. C. (1999). Extraintestinal dissemination of Salmonella by CD18-expressing phagocytes. Nature, 401(6755), 804-808.

【2】Spadoni, I., Zagato, E., Bertocchi, A., Paolinelli, R., Hot, E., Di Sabatino, A., ... & Rescigno, M. (2015). A gut-vascular barrier controls the systemic dissemination of bacteria. Science, 350(6262), 830-834.

【3】Odendall, C., Rolhion, N., Förster, A., Poh, J., Lamont, D. J., Liu, M., ... & Holden, D. W. (2012). The Salmonella kinase SteC targets the MAP kinase MEK to regulate the host actin cytoskeleton. Cell host & microbe, 12(5), 657-668.