Nat Biotechnol：利用新型CRISPR/Cas13靶向冠状病毒SARS-CoV-2等RNA病毒

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Nat Biotechnol：利用新型CRISPR/Cas13靶向冠状病毒SARS-CoV-2等RNA病毒

基于CRISPR的遗传筛选已帮助科学家们鉴定出在镰状细胞性贫血、癌症免疫疗法、肺癌转移和许多其他疾病中起关键作用的基因。但是，这些基因筛选的范围是有限的：它们只能编辑或靶向DNA。对于人类基因组的许多区域，靶向DNA可能并不有效，而且也无法通过现有的DNA靶向性CRISPR筛选靶向诸如RNA病毒（比如冠状病毒或流感病毒）之类的其他有机体。

如今，在一项新的研究中，来自美国纽约基因组中心和纽约大学的研究人员开发出一种新的CRISPR筛选技术，用于靶向RNA。相关研究结果近期发表在Nature Biotechnology期刊上，论文标题为“Massively parallel Cas13 screens reveal principles for guide RNA design”。论文通讯作者为Neville Sanjana博士。论文第一作者为博士后研究员Hans-Hermann Wessels和博士生Alejandro Méndez-Mancilla。

源井生物靶向RNA New York Genome Center

这些研究人员利用了一种最近描述过的称为Cas13的酶，该酶靶向RNA而不是DNA。通过使用Cas13，他们设计了一个优化平台，用于在人细胞中在RNA水平上大规模并行遗传筛选。这种筛选技术可用于了解RNA调节的许多方面，并确定非编码RNA的功能。

通过靶向人RNA转录本中成千上万个不同的位点，这些研究人员开发出一种基于机器学习的预测模型，以加快鉴定最有效的Cas13向导RNA（gRNA）。这种新技术可以让科学家们通过交互式网站和开源工具箱加以使用，以预测定制RNA靶标的gRNA效率，并为所有人类蛋白编码基因提供预先设计的gRNA。

Sanjana博士说，“我们预计靶向RNA的Cas13酶将对分子生物学和医学应用产生重大影响，然而，对于具有高靶向效力的gRNA设计，我们知之甚少。我们打算通过深入而系统的研究来改变这一点，从而针对最有效的gRNA设计，制定出关键原则和预测模型。”

Cas13酶是VI型CRISPR酶，最近被鉴定为具有核酸酶活性的可编程的经gRNA引导、可靶向RNA的蛋白，可在不改变基因组的情况下实现靶基因敲降（即降低靶基因表达）。这一特性使得Cas13成为潜在影响基因表达而不会永久改变基因组序列的重要疗法。

纽约基因组中心首席执行官Tom Maniatis博士说：“这是我们在纽约基因组中心培育和开发的技术创新。来自Sanjana实验室的这种最新CRISPR技术对推动基因组学和精密医学领域发展具有令人兴奋的意义。”

Wessels和Méndez-Mancilla开发出一套基于Cas13的新工具，并在哺乳动物细胞中进行了转录本平铺和排列筛选。这些研究人员总共收集了关于24000多个靶向RNA的gRNA的信息。

Wessels说，“我们针对许多不同的转录本（包括几个人类基因）进行gRNA平铺，在这些基因中我们可以通过抗体染色和流式细胞术轻松测量转录本敲降。在此过程中，我们发现了一些有趣的生物学见解，从而可能会扩大靶向RNA的Cas13酶的应用。”

比如，这些研究人员的发现包括有关gRNA的哪些区域对于识别靶RNA更为重要的新见解。通过使用成千上万个具有1、2或3个碱基错配的gRNA，他们鉴定出一个关键的“种子”区域对CRISPR gRNA与靶标之间的错配非常敏感。这一发现将有助于科学家们设计gRNA，以避免在非预期靶标上产生脱靶活性。由于典型的人类细胞表达约10万个RNA，因此只有Cas13能够准确靶向预期靶标对于筛选和治疗应用至关重要。

除了进一步了解Cas13脱靶外，这个“种子”区域还可能用于下一代生物传感器，从而可以更精确地区分密切相关的RNA分子。总体而言，这项研究将先前在哺乳动物细胞中开展的Cas13研究中产生的数据点数量增加了两个数量级以上。

Méndez-Mancilla说，“我们特别兴奋地使用优化的Cas13筛选系统来靶向非编码RNA。这极大地扩展了用于正向遗传筛选和转录组筛选的CRISPR工具箱。在这项研究中，这些研究人员注意到当靶向信使RNA的不同蛋白编码序列和非编码序列时，蛋白敲降有显著差异，并发现Cas13与参与转录物加工和剪接的其他RNA结合蛋白之间进行竞争的证据。

这些研究人员最近利用他们的gRNA预测模型进行了一项特别关键的分析：COVID-19突发公共卫生事件是由于冠状病毒SARS-CoV-2（之前称为2019-nCoV）引起的，这种冠状病毒包含RNA（而非DNA）基因组。通过使用从大规模并行筛选中得出的模型，他们鉴定出可用于未来检测和治疗应用的最佳gRNA。

参考资料：

1.Hans-Hermann Wessels et al. Massively parallel Cas13 screens reveal principles for guide RNA design. Nature Biotechnology, 2020, doi:10.1038/s41587-020-0456-9.

2.The web tool for predictive scoring of Cas13 guide RNAs

3.Predictions for Cas13 guide RNAs for a strain of SARS-CoV-2 isolated in New York

4.New kind of CRISPR technology to target RNA, including RNA viruses like coronavirus

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