创新CRISPR碱基编辑技术成功延缓ALS小鼠模型疾病进程！
CRISPR碱基编辑器能修改单个碱基，为部分遗传病的精准治疗带来希望，但是碱基编辑器太大了，AAV载体装不下，怎办？伊利诺伊大学研究人员将剪辑编辑器一分为二，用两个独立的AAV将其递送进细胞后再组合为正常编辑器，成功将终止密码引入突变的SOD1基因，关闭基因表达，延缓ALS小鼠的疾病进程。
肌萎缩性侧索硬化症（ALS）是一种逐渐致命的疾病，身残志坚ALS患者——著名理论物理学家霍金，以及为资助渐冻症研究而发起的冰桶挑战，令越来越多人了解和关注这一疾病。尽管肌萎缩性侧索硬化症（ALS）目前尚无法治愈，但部分患者的致病原因可能由超氧化物歧化酶1（SOD1）基因的突变引起，这就成为了研究人员的一个研究突破点。CRISPR碱基编辑器具有修改DNA碱基的能力，有可能用于引入终止密码从而永久关闭突变的SOD1基因表达，为治疗这种疾病带来希望。但是，腺相关病毒（AAV）载体的限制性携带能力限制了其治疗应用。伊利诺伊大学Urbana-Champaign 分校的科学家们报告了他们采用创新的方法利用CRISPR碱基编辑器令ALS小鼠模型中突变的SOD1基因失活，使得基因编辑动物的肌肉萎缩率降低，功能改善。
在这项研究中，研究人员建立了一个内含肽介导的反式剪接系统（intein-mediated trans-splicing system），该系统可在活体内递送一种由化脓性链球菌Cas9蛋白构成的胞嘧啶碱基编辑器（CBE） 。鞘内注射（intrathecal injection）双重AAV腺相关病毒颗粒——其中包含编码的分裂内含肽CBE用于反式剪接，在小鼠模型的突变SOD1基因前端引入了一个终止密码，结果显示延长了编辑小鼠的生存期，并显著减缓了G93A-SOD1 ALS小鼠模型的疾病进程。与对照小鼠相比，使用这种CRISPR碱基编辑器处理的成年小鼠肌肉萎缩率降低，减少了肌肉的去神经化，改善神经肌肉功能，并且末期小鼠的SOD1免疫反应性包含体减少多达40％。
这项工作扩展了单碱基编辑器的功能，并展示了其在基因治疗中的潜力。
生物工程学教授Thomas Gaj与生物工程学教授Pablo Perez共同领导了这项研究，他说：“ALS几乎没有治疗选择。这项研究是重要的第一步，表明这种新形式的基因编辑有望用于治疗这种疾病。”
该方法依赖于一种新兴的基因编辑技术，即CRISPR碱基编辑器。传统的CRISPR基因编辑技术会切割DNA分子的两条链，这可能会在DNA序列中引入各种错误，从而限制了其有效性和潜力，并有可能导致基因组中许多意外突变。Perez-Pinera说，伊利诺伊州研究小组使用碱基编辑器能够“将DNA序列的一个字母更改为另一个字母，而无需切断两条DNA链”。
Gaj说：“腺相关病毒是最有前途的基因治疗载体之一，但是传统的碱基编辑器太大，无法借助腺相关病毒传递到细胞中。” 在2019年，Perez-Pinera的小组开发了一种将碱基编辑器蛋白分成两半、由两个单独的AAV病毒颗粒一起递送到细胞内，这就是前面说的双重AAV方法。一旦进入细胞内，两半便重新组装成全长碱基编辑蛋白。
通过将碱基编辑器分开两半、再结合AAV基因传递功能，Gaj和Perez-Pinera成功在小鼠模型中靶向并永久关闭了突变的SOD1基因——这种基因突变类型约占遗传性肌萎缩性侧索硬化症的20％。他们的研究结果发表在《分子疗法》杂志上。
研究生Colin Lim说：“许多ALS研究的重点是预防或延缓疾病的发作。但是，在现实世界中，大多数患者直到症状出现后才被诊断出来。。。。延缓疾病进展可能会对患者产生更大的帮助。” Lim是该研究的第一作者，作者还包括研究生Michael Gapinske和Alexandra Brooks。
研究人员首先在人体细胞中测试了SOD1碱基编辑器，以验证被一分为二的CRISPR碱基编辑器能够在细胞内重组并且能令SOD1基因的失活。然后他们将编码碱基编辑器的AAV颗粒注入携带突变SOD1基因的小鼠的脊柱中——该SOD1基因突变引起特别严重的ALS形式，在出生后几个月内使小鼠瘫痪。
接受治疗的小鼠表现为疾病进展显著减缓，具有改善的运动功能，更大的肌肉力量，体重减轻程度更少。研究人员观察到，从疾病晚期到末期之间的生存时间增加了85％，总生存期提高了。
Gapinske说：“我们很高兴地发现，疾病发作后出现了许多改善。这告诉我们，我们正在延缓疾病的进展。”
碱基编辑器在SOD1基因的起始位置附近引入了一个终止信号，因此，无论患者具有哪种基因突变，它都具有阻止细胞产生突变蛋白的优势。但是，它同样可能破坏基因的健康版本，因此研究人员正在探索靶向基因突变体拷贝的方法。
Gaj说：“展望未来，我们正在考虑如何将这项技术和其他基因编辑技术带入临床，以便有朝一日能够治疗患者的ALS。” “为此，我们必须开发能够靶向该疾病所涉及的所有细胞的新策略。我们还必须在其他临床相关模型中进一步评估这种方法的效率和安全性。”
Perez-Pinera说，基于碱基的编辑方法也具有利用遗传学方法治疗其他遗传疾病的潜力。尽管ALS是该工具的首个演示，但他的小组正在进行研究以将其应用于Duchenne肌营养不良症和脊髓性肌萎缩症。
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