新里程——第一个可以精确控制CRISRP/Cas9基因编辑的小分子抑制剂

源井生物今日阅读推荐：近年来，基因编辑技术备受关注，科学家一直致力于开发“抗CRISPR”系统，来干扰细胞中的Cas核酸酶功能，以此来给CRISPR基因编辑技术带上一定程度的“镣铐”，规范该技术的使用操作。

自2012年“魔剪”技术出道以来，该技术一直备受争议。一些专家指出，基因编辑在很多层面上难以实现控制。近年来，科学家一直致力于开发“抗CRISPR”系统，来干扰细胞中的Cas核酸酶功能，以此来给CRISPR基因编辑技术带上一定程度的“镣铐”，规范该技术的使用操作。

如今，在美国Broad研究所开发的高通量检测方法下，这一“抗CRISPR”系统迎来了第一位成员：SpCas9(化脓性链球菌 Cas9)的小分子抑制剂。相关研究已经发表在《Cell》杂志上。

DOI：https ：//doi.org/10.1016/j.cell.2019.04.009

CRISPR-Cas9与SpCas9

最新研究表明，许多基因工程技术的实施都需要依赖准确地CRISPR-Cas9系统进行有效控制才能保证基因编辑的准确有效性。而Cas9在CRISPR基因编辑技术中作为最常用DNA切割酶，十分容易引起基因组的改变。我们发现它在细菌的脓性链球菌 Cas9（SpCas9）上存在量较多。

目前SpCas9正被开发为多种疾病的基因治疗药物，包括HIV、视力障碍、肌肉萎缩症和其他遗传性疾病等。然而，治疗中不断高发的脱靶效应、染色体易位、基因毒性等副作用，让治疗手段尤其是对SpCas9的治疗剂量和时间的调控变得尤为重要。

来自美国Broad研究所的Amit Choudhary博士及其同事最终也将“抗CRISPR”的研究目光也锁定在Cas9的最初来源的脓性链球菌 Cas9（SpCas9）上。同时，他们通过一系列生化和细胞水平的测定，筛选出针对SpCas9的小分子抑制剂，使得对“抗CRISPR-Cas9”基因编辑系统有了更加行之有效的控制。

Amit Choudhary博士 图片来源：Vilcek Foundation

SpCas9小分子抑制剂的发现

在此研究之前，科学家已经发现靶向SpCas9的抗CRISPR蛋白的存在，但这类蛋白体积很大，而且不易被细胞渗透，在作用中不可逆转，还存在可能被蛋白酶降解的风险，甚至可能在哺乳动物体内造成不良免疫反应的风险。

因此，在此研究中，研究人员选取小分子作为“抗CRISPR”蛋白的新型对象，筛选出一组多样化的小分子，通过识别化合物结构来破坏SpCas9与DNA的结合，从而达到干扰SpCas9对DNA进行切割的作用。

高通量初级和二级分析

研究人员还发现，这些小分子抑制剂可以稳定地进入细胞，且比先前发现的一些抗CRISPR蛋白要小的多，同时这样的小分子抑制剂能够对SpCas9实现行动可逆，剂量可控，相对稳定且温和的控制。这样的“抗CRISPR蛋白”抑制剂的发现，对应用于哺乳动物细胞的基因编辑，碱基编辑，和表观遗传编辑具有重要意义。

SpCas9的小分子抑制剂的鉴定和验证

Amit Choudhary博士对此项研究评价道：“这些研究结果为精确控制CRISPR-Cas9活性奠定了基础。然而，这些分子抑制剂目前还没有在生物体内进行有效性测试，距离人类应用还有很长一段路要走。”

接下来，研究人员将致力于两个方向的研究：第一，确定这类抑制剂在SpCas9：gRNA复合物上的结合位点，并检查其作用机制，优化其效力。第二，确定这类分子抑制剂能否作用于哺乳动物细胞中的其他靶标，并评估它们对其他CRISPR相关核酸酶的特异性。

参考文献：

[1] A High-Throughput Platform to Identify Small-Molecule Inhibitors of CRISPR-Cas9

[2] CRISPR Under Control: Small-Molecule Inhibitors of Cas9 Identified

[3] Enhanced proofreading governs CRISPR–Cas9 targeting accuracy