CRISPR衍生系统实现剂量依赖性的表达激活

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北卡罗来纳大学教堂山分校、国立卫生研究院等机构的研究人员开发出一种基于CRISPR-Cas9的系统，可以利用化学表观遗传修饰因子（CEM）来实现基因表达的激活，而无需使用外源的转录调控蛋白。

北卡罗来纳大学教堂山分校、国立卫生研究院等机构的研究人员开发出一种基于CRISPR-Cas9的系统，可以利用化学表观遗传修饰因子（CEM）来实现基因表达的激活，而无需使用外源的转录调控蛋白。


这项成果于本周发表在《Nature Biotechnology》杂志上。此系统由两部分组成，其一是带有FK506结合蛋白（FKBP）的催化失活Cas9（dCas9），其二则是CEM，它可以招募内源的转录调控因子，从而激活目标基因的表达。


作者写道：“我们证明，CEM可以使内源位点的基因表达上调20多倍。我们还证明了转录激活的剂量依赖性控制、在多个不同基因上的作用、CEM活性的可逆性以及我们最佳的CEM在整个基因组中的特异性。”

在之前的研究中，科学家证明了CEM能够修饰染色质并抑制改造位点的基因表达。在这项新研究中，他们开发出CEM激活（CEMa）分子，可以招募内源性基因激活机制，包括CEM87、CEM88和CEM114。这些分子分别与不同的转录激活因子相结合。


为了检验基因表达的变化，研究人员利用绿色荧光蛋白（GFP）基因转染了HEK293T细胞，并对共表达gRNA和dCas9机制的细胞开展流式分析。他们用共表达dCas9-FKBP×1或dCas9-FKBP×2以及CEMa分子的质粒激活报告基因。在48小时后，他们发现GFP报告基因的表达均有显著增强。


在优化dCas9系统后，研究人员选择了两个最有效的CEMa分子（CEM87和CEM114）开展时间进程分析。他们用表达dCas9、MS2-FKBP×2和GFP的质粒转染细胞。与未处理的细胞相比，经过CEM87和CEM114处理的细胞在24小时和48小时后产生了GFP高表达。他们还发现，CEM对目标基因的激活调控是可逆的。


为了研究dCas9-CEMa系统的多功能性，研究人员利用靶向白介素1受体拮抗基因（IL1RN）的gRNA进行了测试。与对照细胞相比，经过CEM87处理后，IL1RN基因的表达增强了近96倍。同时，他们还靶向了表达量相对较高的MYC1位点，发现CEM87并未明显增强其表达。


作者总结道：“通过CEMa技术与dCas9载体的融合，我们理论上可以通过该系统来靶向基因组中的任何基因。这种dCas9-CEMa技术为靶向疾病相关的基因铺平了道路，有望解答与疾病机理相关的问题。”


原文检索

Chiarella, A.M., Butler, K.V., Gryder, B.E. et al. Dose-dependent activation of gene expression is achieved using CRISPR and small molecules that recruit endogenous chromatin machinery. Nat Biotechnol (2019) doi:10.1038/s41587-019-0296-7

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