利用CRISPR-Cas9实现对甘蓝型油菜LPAT基因的功能解析

源井生物今日阅读推荐：甘蓝型油菜（Brassica napus）是最为重要的油料作物之一，研究其油脂合成与代谢对培育高含油量油菜品种具有重要意义。甘蓝型油菜是由白菜和甘蓝杂交进而经过染色体加倍而形成的异源四倍体，高效地敲除其所有基因拷贝对研究甘蓝型油菜含油量基因调控具有重大意义。详情如下：

具有靶序列的BnLPAT基因模型和二元载体示意图。一，b的的图BnLPAT2和BnLPAT5基因模型。外显子用蓝色矩形显示，而内含子用黑色线显示。BnLPAT基因保守CDS区域中的靶位点。SNP以浅红色突出显示。PAM为绿色，而gRNA为黄色。c，d单-gRNA和多-gRNA介导的CRISPR-Cas9构建体的图。Cas9蛋白的表达由2X 35S启动子驱动，在N端带有2x核定位信号（NLS）。在拟南芥 启动子U6-26用于驱动sgRNA表达

使用CRISPR-Cas9在甘蓝型油菜中进行基因编辑的示意图。甘蓝型油菜的单gRNA（上部）和多gRNA（下部）介导的基因编辑。E，编辑；NE，非编辑。b Single-gRNA介导的靶标，用于在CRISPR-Cas9介导的裂解中敲除。chrA07中的测序结果分别列在g1行，g2行和g3行中，并在g4行的公共位点列出。C用于CRISPR-Cas9介导的裂解的多gRNA介导的靶标。“-”和“ +”指示靶序列中的核苷酸插入和缺失，而“ s”指示取代的突变，而“ c”指示组合的突变。五角星形的红色表示在目标位置的插入。gRNA染成黄色，而PAM染成绿色

基因敲除的转基因后代表型发生了明显变化，Bnlpat2和Bnlpat5突变株的成熟种子和野生型相比，种子出现了明显干瘪，含油量明显下降；透射电镜观察表明Bnlpat2、Bnlpat5及Bnlpat2/Bnlpat5突变株系种子的油体数量明显变少，且部分株系中出现了超大油体。含油量分析表明：单靶点敲除Bnlpat2突变系中含油量平均下降了32%，Bnlpat5突变系平均下降了29%，同时敲除LPAT2/LPAT5的多靶点突变系含油量下降了39%。本研究对于甘蓝型油菜等多倍体植物的基因功能研究具有借鉴作用。

https://biotechnologyforbiofuels.biomedcentral.com/articles/10.1186/s13068-019-1567-8

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