一文了解荧光素酶报告基因细胞系解决方案

一、荧光素酶报告基因实验技术原理

荧光素酶是一类能够催化荧光素（luciferin）氧化反应产生生物发光信号的酶。常见的荧光素酶包括萤火虫荧光素酶（Firefly luciferase, FLuc）、海肾荧光素酶（Renilla luciferase, RLuc）和高斯荧光素酶（Gaussia luciferase, GLuc）等。荧光素酶报告基因技术广泛用于基因表达调控和药物筛选等研究。以荧光素酶报告基因检测系统为例：将目标基因启动子或调控序列克隆到荧光素酶基因上游，转染细胞后通过添加底物（如萤光素等）产生发光信号，发光强度与基因转录活性成正比。与绿色荧光蛋白（GFP）不同，荧光素酶发光检测无需外部激发光，且在多数细胞中不表达，背景极低；其发光穿透力强、动态范围宽、灵敏度高。基于荧光素酶的报告基因检测具有超高灵敏度和宽动态范围，因此被广泛使用。因此，荧光素酶报告系统是理想的量化检测工具。

图 1 荧光素酶报告基因实验原理

单/双报告基因检测系统

• 单报告基因检测系统 ：仅检测一种荧光素酶活性，操作步骤相对简单，但易受细胞数目或蛋白含量等样本差异干扰。实验中通常需根据细胞数或蛋白量对数据进行归一化。
• 双荧光素酶报告基因检测系统 ：使用两种荧光素酶质粒（如FLuc和RLuc）共转染：萤火虫荧光素酶（FLuc）用于检测实验信号，Renilla荧光素酶（RLuc）作为内参。两种酶使用不同底物，分别产生不同波长的光信号，可有效校正转染效率和细胞活力差异。上述系统结合了两种荧光素酶的优势，广泛用于精确检测。

二、常见报告基因系统比较

常见报告基因包括β-半乳糖苷酶（LacZ）、氯霉素乙酰转移酶（CAT）、荧光蛋白（GFP）和荧光素酶等，各有适用场景。CAT测定灵敏度高但操作繁琐；LacZ常用作转染内参；GFP可实时观察活细胞，但需外部激发光且组织内自发荧光干扰大。与此不同，荧光素酶报告基因依赖底物-酶特异性反应发光，无须激发光且本底低。此外，荧光素酶信号稳定且量程宽，反应快速，易于高通量筛选和联合报告检测，因此在基因表达调控、细胞示踪以及药物筛选中得到广泛应用。

报告基因	检测方法/底物	优势	典型应用
荧光素酶 (Luciferase)	荧光素 (luciferin) 激发后发光	灵敏度高、响应快速、无激发光、背景低	转录调控研究、体内细胞示踪、药物筛选
荧光蛋白 (GFP等)	488 nm激发光发荧光	可实时观察细胞/蛋白分布	活细胞示踪、定位（长期观察）
β-半乳糖苷酶 (LacZ)	O-nitrophenyl-β-D-galactopyranoside 分解显色	容易检测	转染效率校正、内参
CAT	乙酰CoA 与氯霉素生成乙酰氯霉素	灵敏、低背景	基因表达测定（过时方法）

表1 不同的报告基因系统的比较分析

三、荧光素酶标记稳定细胞系（Luc稳转细胞株）构建与应用

• 实验目的： 构建荧光素酶标记稳定细胞系（Luc细胞系）可用于实时监测基因表达或细胞行为，常用于研究转录因子-启动子相互作用、miRNA-靶基因互作、信号通路激活以及药物/小分子筛选等。
• 实验步骤：

  • 质粒构建： 根据研究目的选择合适的质粒。在研究转录因子对基因表达的影响时，通常选用20载体和pRL载体，其中pGL4.20载体的FLuc基因上游无启动子，为多克隆位点，可插入感兴趣的启动子序列。pRL系列载体主要是启动子不同，可依据不同实验需要，选择合适的启动子，通常选择活性较弱的TK启动子。

    

    图2 pGL4.20载体与pRL系列载体示意图

    在研究microRNA和mRNA互作时，可选用pMIR-REPORT Luciferase，其中FLuc的3’UTR端有多克隆位点，可将靶基因的3’UTR插入到该位点。该质粒的内参是pMIR-REPORT™ β-半乳糖苷酶报告基因对照载体。此外，还可将内参基因和报告基因放在同一个质粒上，该质粒名称为pmirGLO，用于评估miRNA的活性。

    

    图 3 pmirGLOP载体示意图

  • 细胞转染： 转染试剂可为PEI、氯化钙、lipofectamine2000等。若使用双质粒系统，内参基因质粒与报告基因质粒的比值大概为1：10，确保内参基因不影响报告基因的表达。转染后的24-36h，进行相应检测。

  • 报告基因检测： 裂解细胞，离心取培养基上清，加入到96孔板内。加入相应的FLuc缓冲液，检测荧光值。再加入STOP+RLuc缓冲液，并检测荧光值。

• 数据分析

  • 计算出每孔的Firefly Luciferase/ Renilla Luciferase 的荧光强度的比值。

  • 计算对照组多个复孔的平均值Average-control，并用实验组的荧光值比值除以该平均值得出“归一化”后的值，相当于将对照组的值当作“1”进行数据分析。

  • 将归一化后的对照组与实验组数据绘制柱状图，进行统计分析。

• 应用场景：

  • 转录因子-启动子互作： 将靶基因启动子克隆到FLuc载体中，转染可上调或抑制该转录因子的表达载体，检测FLuc信号变化验证其调控功能。

    

    图 4 研究转录因子与靶基因启动子的互作的示意图

  • miRNA-靶基因验证： 将候选miRNA靶基因的3′UTR插入FLuc下游，联合miRNA模拟物转染；若miRNA与靶序列结合，FLuc信号降低，说明miRNA对该基因存在抑制作用。

  • 信号通路活性检测： 将通路响应元件（RE）序列接到最小启动子和FLuc之间，共转表达相应因子，刺激后观察FLuc信号变化，反映通路激活状态。

  • 药物/小分子筛选： 通过CRISPR/Cas9将Luc基因敲入特定靶基因内，形成融合蛋白；药物处理后检测Luc信号变化，可用于高通量筛选调控该蛋白表达的小分子。

    

    图 5 高通量筛选小分子对蛋白表达的影响示意图

  • 其他应用： 还可用于荧光素酶检测试剂盒开发（如ELISA结合Luc）、病毒载体表达验证、动物体内成像等。荧光素酶报告因其高灵敏度和可量化特性，已成为基因表达与功能研究的“金标准”。

四、荧光素酶稳定细胞系（Luc Stable Cell Line）的特征评估

构建稳定Luc细胞系后，应进行以下验证：

• 表达水平与发光稳定性： 使用荧光素酶检测试剂盒测量不同细胞批次的发光强度及发光持续时间，选择发光强、信号衰减缓慢的细胞株。
• 细胞鉴定： 进行STR鉴定以确认细胞系身份；同时进行支原体检测，确保细胞无污染，提高实验可重复性。
• 功能验证： 检测细胞相关生物标志物或表型，确保插入Luc基因后不影响细胞正常功能。
• 应用场景选型： 根据研究需求选择合适细胞系来源，例如肿瘤体内示踪研究可选取Luc标记的肿瘤细胞系，信号通路研究可选用荧光素酶报告HepG2等易转染细胞

五、常见问题解答（FAQ）

1.Q1: 发光值过高怎么办？

A1： 当发光信号超出仪器检测范围时，可减少转染质粒量或接种细胞数，或将裂解液适当稀释，避免信号饱和。

2.Q2: 发光值过低怎么办？

A2： 如果发光信号接近背景，应增加转染质粒量和细胞数，减少裂解液量，或优化转染条件，以提高发光信号。

3.Q3: 平板孔间差异大怎么办？

A3： 使用多通道移液器时保证每个枪头插稳，避免产生气泡；对于裂解液，离心后取上清使用，以保证样本均一性，减少孔间误差

六、源井生物 Luc 稳转细胞株 & Luc 报告基因细胞系

源井生物现提供 300+种 Luc 稳转细胞系 ，均采用慢病毒（Lentivirus）转导技术构建，可稳定表达萤火虫荧光素酶（Firefly Luciferase, Luc）。所有细胞株均已完成荧光素酶活性检测，具有信号特异性强、灵敏度高、成像稳定性好及发光信号可定量分析等特点。所有 Luc 稳转细胞系均通过 STR 细胞身份鉴定及支原体检测（覆盖75种常见支原体），确保细胞来源可靠且无污染。细胞整体处于低传代状态，活性高、状态稳定，可直接用于体内注射实验，广泛适用于转录因子调控机制研究、活体生物发光成像（Bioluminescence Imaging, BLI）、细胞示踪及药效评价等研究方向。

此外，源井生物同时提供 Luc 报告基因细胞系定制服务 ，可用于精准监测信号通路活性，具有稳定性高、重复性好的特点。可提供从模型构建到功能验证的一站式服务，广泛应用于药物筛选、靶点验证及机制研究等领域， 欢迎咨询专属技术方案>>