IF=14.9 | 源井生物助力创新基因编辑策略 LOTI 突破大片段整合难题，推动实现高效精准基因治疗

引言

CRISPR-Cas9系统为基因治疗带来了革命性前景，但在体细胞中实现大片段DNA的高效、精准、低脱靶整合仍是领域内的重要挑战。海南大学与华中科技大学联合团队在Trends in Biotechnology发表的最新研究中，提出了一种创新性基因编辑策略—— 长偏移配对切口靶向整合（Long-Offset paired nicking-based Target Integration, LOTI）。 该策略利用Cas9切口酶在基因组和供体模板上引入长距离配对切口，成功在小鼠肝脏中实现高效、精准的基因敲入，并在血友病B模型中恢复55%的凝血因子活性，为在体基因靶向整合提供了一种高效、精准且安全的新方法。源井生物 单克隆基因型鉴定试剂盒(免抽提) 为本研究开发创新性基因编辑策略提供重要工具。

研究背景

基于CRISPR-Cas9的基因编辑技术已在基因敲除和小片段修复中取得显著进展，但在体细胞中进行长片段靶向整合仍面临效率低、脱靶率高、随机插入多等瓶颈。传统方法依赖双链断裂诱导的同源定向修复，在非分裂或低增殖细胞中效率有限，且易引入非预期突变。因此，开发一种避免双链断裂、兼顾高效与精准的整合策略，对遗传病基因治疗具有迫切意义。

研究方法

• LOTI策略设计: 利用Cas9切口酶在基因组靶位点引入一对距离≥200 bp的切口，同时在供体DNA左右同源臂及内部设计配对切口，形成“基因组双切口+供体三切口”的结构。
• 细胞与动物模型: 在B16、HEK293、HeLa等多种细胞系及原代星形胶质细胞中测试敲入效率；通过细胞周期抑制剂验证其在非增殖细胞中的编辑能力；建立血友病B小鼠模型，通过高压水动力注射递送编辑元件至肝脏。
• 效率与安全性评估: 通过流式细胞术、免疫荧光、深度测序等多维度评估敲入效率、脱靶效应、插入缺失突变及随机整合情况。
• 机制探究: 利用siRNA敲低及小分子抑制剂，解析LOTI依赖的修复通路关键因子。

研究路线

• 策略构建与优化： 设计并验证长偏移配对切口在基因组与供体模板上的必要性，优化同源臂长度与切口布局。
• 体外效率验证： 在多种细胞系中比较LOTI与传统方法（HDR、HMEJ、MMEJ等）的敲入效率与精准度。
• 体内编辑验证： 在小鼠肝脏中验证LOTI的高效靶向整合能力，并评估其脱靶与安全特性。
• 机制解析： 明确LOTI依赖Rad51、Rad52、Ligase I/III等修复蛋白，而非经典NHEJ或HDR通路。
• 疾病模型治疗: 在血友病B小鼠中实现FIX基因靶向整合，恢复凝血功能，验证其治疗潜力。

LOTI策略及其应用

主要结果

• LOTI显著提升体细胞敲入效率： 在多种细胞系及小鼠肝脏中，LOTI的敲入效率显著高于传统单切口或双链断裂策略，长偏移设计（≥200 bp）是关键。

  

  图1. LOTI策略在体内外基因编辑效率检测

• 高效且低脱靶： 在脱靶效应和准确性方面，与基于Cas9双链断裂策略相比，LOTI策略不仅降低了目标位点的indels频率和目标片段的随机整合率，其在脱靶位点的indels频率也降低了10-100倍。

  

  图2. LOTI策略脱靶情况检测

• 适用于非增殖细胞及其他Cas9变体： LOTI策略不仅在鼠源B16细胞中表现出色，在HEK293和HeLa等人源细胞系、增殖阻滞的细胞及小鼠原代星形胶质细胞中有不错的敲入效率。此外，LOTI策略在SaCas9-D10A切口酶中同样有效，提示LOTI策略可能适用于其他类型的CRISPR切口酶中。

  

  图3. LOTI策略在增殖阻滞细胞及原代星胶细胞中基因编辑效果

• 有效治疗血友病B小鼠模型 血友病B是由凝血因子IX（FIX）基因的突变或缺失导致的遗传性凝血障碍疾病，其表现为凝血功能障碍。通过构建针对FIX基因的LOTI靶向整合策略，并利用高压水动力注射方式将设计的编辑元件递送至血友病B疾病模型小鼠体内。单次注射LOTI元件可在F9-KO小鼠肝脏中实现FIX基因整合，恢复55%凝血活性，mRNA与蛋白表达均得到有效恢复。

  

  图4. LOTI策略在B型血友病小鼠中的应用

研究意义与创新点

• 策略创新： 首次提出“长偏移配对切口+供体多切口”协同设计，实现体细胞中大片段基因的高效、精准整合，突破传统依赖双链断裂的编辑瓶颈。
• 机制新颖： 揭示LOTI通过激活Rad51/Rad52依赖的非经典修复通路，独立于细胞周期，为理解切口引导的基因整合机制提供新视角。
• 治疗突破： 在血友病B模型中实现单次给药下的高效基因矫正，为重大片段缺失类遗传病的在体基因治疗提供安全、可行的技术路径。
• 平台潜力： LOTI具备多酶适配、低脱靶、高精度的特点，为多种遗传病、代谢病及肿瘤基因治疗提供了可推广的编辑工具。

文章小结

本研究开发的LOTI策略，通过长偏移配对切口与供体多重切口的协同设计，在体细胞中实现了高效、精准、低脱靶的长片段基因整合，并在血友病B小鼠模型中验证其治疗效力。该工作为基因编辑工具开发提供了新思路。

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参考文献

Lu Y, Wang J, Xu Y, Xu M, Li B, Fan Z, Liu J, Li X, Cai Z, Zheng Y, Wang W, Yang J, Zhang Z, Liu Z. Long-offset paired nicking-based efficient and precise strategy for in vivo targeted insertion. Trends Biotechnol. 2025 Jul;43(7):1743-1764. doi: 10.1016/j.tibtech.2025.02.020. Epub 2025 Apr 7. PMID: 40199626.