干货丨LLC细胞培养和基因编辑Tips

LLC细胞是从 C57BL 小鼠的肺中建立的，该细胞系被广泛用作转移模型，可用于研究癌症化疗药物的作用机制。据报道，此细胞为高转移性和耐药性小鼠肿瘤细胞。小源现在就奉上LLC细胞独家培养秘籍，带大家一次性解锁LLC细胞的培养技巧与基因编辑实操要点！

一、小鼠肺癌细胞(LLC)基本信息

• 细胞名称： 小鼠肺癌细胞(LLC)
• 细胞形态： 上皮样、圆形细胞混合
• 细胞培养条件： 90%DMEM+10%FBS
• 气相： 空气，95%；二氧化碳，5%
• 温度： 37℃
• 换液频次： 传代时换液
• 传代比例: 1:2-1:3

细胞生长状态参考：

正常状态： 细胞形态不均一，上皮样细胞与圆形细胞同时存在，比例不定，均以贴壁状态存在；可能存在少量悬浮细胞。（见下图）

异常状态： 异常状态：细胞拉丝或拉长；细胞萎缩、变圆；细胞碎片增多。（见下图）

二、LLC细胞复苏流程

• 准备培养基 取7mL完全培养基于离心管中备用。
• 细胞解冻 将细胞从干冰里取出，用镊子夹住盖子放入 37℃水浴中快速晃动（注意：水不能没过盖子），使其在1分钟左右完全融化，直至冰块融化至绿豆大小，停止水浴。
• 细胞离心 将解冻后的细胞悬液转移至离心管中，1100rpm条件下离心4分钟，弃去上清液。
• 重悬与接种 用完全培养基重悬细胞，接种于合适大小的培养皿或培养瓶中。
• 细胞培养 将培养皿或培养瓶置于37℃培养箱中培养，24小时后观察细胞状态及贴壁情况。

三、LLC细胞传代步骤（以T25瓶为例）

• 传代条件
  当细胞汇合度达到80-90%时可进行传代。
  传代时在超净台内弃去培养瓶里的培养液，加入5mLPBS洗涤细胞1-2次。
• 胰酶消化
  加入1mL胰酶，轻轻晃动瓶子并使胰酶完全浸过细胞。
  将培养瓶放入培养箱孵育 1-2分钟。
  待在显微镜下观察到大部分细胞变圆变亮，轻轻晃动培养瓶两侧有大部分细胞脱落时，立即终止消化。
• 终止消化
  加入2倍胰酶体积即2mL完全培养基终止消化。
  然后转移至15mL离心管中。
• 细胞悬液离心
  1100rpm室温离心4分钟。
  离心结束，弃去上清，加入完全培养基重悬细胞。
• 传代培养
  细胞按照1:2-1:3比例传代。
  传代第二天观察细胞状态。

四、LLC细胞冻存步骤

• 收集细胞
  按照细胞传代的过程收集消化好的细胞到离心管中。
• 离心
  1100rpm条件下离心4分钟，去掉上清。
• 重悬与冻存
  用细胞冻存液重悬细胞，按每1mL冻存液含1×10^6个细胞/mL分配到冻存管中，标注好名称、代数、日期等信息。
• 降温与储存
  将冻存管置于程序降温盒中，-80℃冰箱中过夜后转入液氮罐内保存。

五、HTR-8/SVneo细胞培养注意事项

• 细胞状态： 在细胞生长至80%汇合度时传代最佳。

• 培养基保存： 确保培养基储存于4°C避光，并在有效期内使用。

• 培养环境： 确保细胞培养环境正常。

• 操作细节： 操作前需预热培养基和胰酶至37℃，避免温度应激。

• 细胞传代操作： 避免过度吹打而造成细胞膜的损伤；贴壁不均匀时可轻摇培养瓶使细胞分布均匀。

• 选用高质量血清： LLC 细胞对血清质量较为敏感，需要高质量的胎牛血清进行培养，细胞才会呈贴壁生长，否则可能会引起细胞状态变化。

【小提示】： 细胞培养时可能存在少量悬浮细胞，当贴壁细胞占据多数时，悬浮细胞可以舍弃；当悬浮细胞较多时，可离心收集并接种回培养瓶。

六、LLC细胞转染时注意事项

• 细胞状态要求
  • 确保细胞状态良好，使用处对数生长期即 汇合度在70-80% 的细胞。
  • 细胞活率＞80%，可通过台盼蓝进行检测。
  • 使用 低代次细胞。
  • 注意细胞消化时间， 避免过度消化 ，对细胞造成伤害。
  • 实验过程中细胞要吹打成单细胞，避免细胞聚团。
• 转染试剂与预实验
  • 转染试剂使用前需要充分混匀保证其均匀性。
  • 建议进行药筛预实验找到 最佳药筛浓度 ，以便于转染后进行药筛。
• 电转法
  • 控制细胞量，电转后根据细胞量接种至合适的培养板里。
  • 使用温和的胰酶，并用含血清的培养基彻底终止消化。
  • 用PBS洗涤细胞1-2次，彻底去除残留血清，避免离子干扰电穿孔。
  • 进行预实验对电转参数进行优化。
  • 保证电转后细胞贴壁率≥50%。
  • 控制实验时间，电转全程不宜过长。
• 慢病毒法
  • 进行预实验找到最合适的MOI。
  • 感染病毒前细胞汇合度控制在30-40%之间，不可过高。
  • 感染前添加助染剂Polybrene。
  • 感染后24h进行换液。
  • 感染使用的病毒液避免反复冻融。
  • 若感染效率过低可进行复感染（需确保细胞对病毒耐受性良好）或尝试使用离心法感染。

七、LLC细胞铺单克隆实验注意事项

• 细胞状态要求
  • 使用对数生长期的细胞进行铺克隆，铺克隆前细胞汇合度建议控制在60%-70%左右。
  • 铺克隆时细胞活率≥80%。
• 试剂与预实验
  • 提前预温所有试剂（包括培养基、PBS）。
  • 建议使用温和消化试剂（如TrypLE Express）。
• 铺板策略
  • 进行预实验找到合适的铺克隆梯度，避免单克隆占比太低。
  • 细胞接种96孔板时需确保细胞分布均匀；外围96孔加入PBS防止蒸发。
  • 在单克隆培养期间，需要避免频繁晃动，以减少单细胞克隆脱落或迁移的风险。
• 稀释方法
  • 使用“极限稀释法”进行铺克隆。
  • 稀释细胞计数后结果最好落在1*10^6-2*10^6之间。
  

  慢病毒感染后细胞图