干货丨Hep 3B细胞培养和基因编辑Tips

Hep 3B 细胞是肝癌研究常用模型，取自人类肝癌组织，因肝癌细胞表型稳定、能模拟体内部分生长代谢特点，且增殖活性与实验重复性较好，常用于肝癌细胞特性研究、抗肿瘤药物筛选及相关基因功能验证。其细胞形态与HepG2相似，不同的是，Hep 3B整合了完整的HBV基因组，可用于HBV感染后发展致癌相关研究。要想在实验中稳定发挥Hep 3B 的作用，还需关注具体的操作细节，这样才能减少实验误差，确保数据的可靠性。今天，小源就把自己的宝藏秘籍——Hep 3B细胞培养和基因编辑技巧分享给你。

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细胞名称：人肝癌细胞（Hep 3B）

细胞形态：上皮样细胞，贴壁生长

细胞培养条件：87%MEM+10%FBS+1%Glutamax+1%Sodium Pyruvate+1%NEAA

气相：空气，95%；二氧化碳，5%

温度：37℃

换液频次：2-3天/次

传代比例：1:2-1:4

细胞生长状态参考 ：

● 正常状态：细胞通常呈上皮多边样，细胞与细胞之间的边界在显微镜下清晰可辨，单层生长不重叠，胞质饱满透亮（如下图）

● 异常状态：细胞从多边上皮样拉长变为长梭形，细胞扁平化，细胞不饱满，折光性差；细胞碎片增多或胞质内出现大量大小不一的透明空泡（如下图）

1.准备培养基

取7mL完全培养基于离心管中备用

2.细胞解冻

将细胞从干冰里取出，用镊子夹住盖子放入 37℃水浴中快速晃动（注意：水不能没过盖子），使其在1分钟左右完全融化，直至冰块融化至绿豆大小，停止水浴

3.细胞悬液离心

将解冻后的细胞悬液转移至离心管中，1100rpm条件下离心4分钟，弃去上清液

4.重悬与接种

用完全培养基重悬细胞，接种于合适大小的培养皿或培养瓶中

5.细胞培养

将培养皿或培养瓶置于37℃培养箱中培养，24小时后观察细胞状态及贴壁情况

1.传代条件

● 当细胞汇合度达到80-90%时可进行传代

● 传代时在超净台内弃去培养瓶里的培养液，加入5mLPBS洗涤细胞1-2次

2.胰酶消化

● 加入1mL胰酶，轻轻晃动瓶子并使胰酶完全浸过细胞

● 将培养瓶放入培养箱孵育 2-3分钟

● 显微镜下观察到大部分细胞变圆变亮，轻轻晃动轻易脱落时，立即终止消化

3.终止消化

● 加入2倍胰酶体积即2mL完全培养基终止消化

● 细胞悬液转移至15mL离心管中

4.细胞悬液离心

● 1100 rpm 室温离心 4 分钟

● 离心结束，弃去上清

● 加入完全培养基重悬细胞

5.细胞传代

● 按照1:2-1:4比例接种至新的培养瓶

● 传代第二天观察细胞状态

1.收集细胞

按照细胞传代的过程收集消化好的细胞到离心管中

2.细胞悬液离心

1100rpm条件下离心4分钟，去掉上清

3.重悬与冻存

● 用细胞冻存液重悬细胞，按每1mL冻存液含1×10^6个细胞/mL分配到冻存管中

● 冻存管上注明好名称、代数、日期等信息

4.降温与储存

将冻存管置于程序降温盒中，-80℃冰箱中过夜后转入液氮罐内保存

1.培养基和血清：确保使用正确的基础培养基和加入适量血清，配好的完全培养基需4℃保存，建议2周内使用完毕

2.培养环境：确保细胞培养环境正常

3.提前预热：操作前需预热培养基和胰酶至37℃，避免温度应激

4.避免消化时间过长：细胞对消化敏感，注意消化时间和胰酶浓度，避免因消化时间过长或过短导致的细胞损伤

5.细胞传代操作要点：避免过度吹打而造成细胞膜的损伤；贴壁不均匀时可轻摇培养瓶使细胞分布均匀

6.背景出现黑点：培养时背景中可能有较多黑点，为细胞代谢产物和细胞碎片，不影响细胞生长。若黑点较多可以在换液时用PBS轻轻润洗1-2次

1.细胞状态要求

● 确保细胞状态良好，使用处对数生长期即汇合度在70-80%的细胞，

● 细胞活率＞85%，可通过台盼蓝进行检测

● 使用低代次细胞

● 注意细胞消化时间，避免过度消化，对细胞造成伤害

● 实验过程中细胞要吹打成单细胞，避免细胞聚团

2.转染试剂与预实验

● 转染试剂使用前需要充分混匀保证其均匀性

● 建议进行药筛预实验找到 最佳药筛浓度 ，以便于转染后进行药筛

3 . 电转法

● 控制细胞量，电转后根据细胞量接种至合适的培养板里

● 使用温和的胰酶，并用含血清的培养基彻底终止消化

● 用PBS洗涤细胞1-2次，彻底去除残留血清，避免离子干扰电穿孔

● 进行预实验对电转参数进行优化

● 保证电转后细胞贴壁率≥70%

● 控制实验时间，电转全程不宜过长

4.慢病毒法

● 进行预实验找到最合适的MOI

● 感染病毒前细胞汇合度控制在30-40%之间，不可过高

● 感染前添加助染剂Polybrene

● 感染后24h进行换液

● 感染使用的病毒液避免反复冻融

● 若感染效率过低可进行复感染（需确保细胞对病毒耐受性良好）或尝试使用离心法感染

5.脂质体法

● 选择适合Hep 3B细胞的脂质体转染试剂

● 通过预实验重新优化DNA/试剂比例，确定最佳转染条件

● 使用增强剂：有些试剂系统提供专门的增强剂，可以显著提高在某些难转染细胞中的效率

● 转染前24h进行细胞铺板，转染前细胞汇合度控制在60-70%

● 先稀释DNA于Opti-MEM，再加脂质体（反向混合会失效）

● 室温静置15-20分钟（＜10分钟复合不充分，＞30分钟毒性增加）

● 转染培养基中严禁添加抗生素，因阳离子脂质体可增加细胞通透性，导致抗生素进入细胞引发毒性

● 复合物添加时应均匀、缓慢地滴加到培养基里，并轻摇混匀，避免直接冲击细胞，切忌剧烈吹打

1.细胞状态要求

● 使用对数生长期的细胞进行铺克隆，铺克隆前细胞汇合度建议控制在70%左右

● 铺克隆时细胞活率≥85%

2.试剂与预实验

● 提前预温所有试剂（包括培养基、胰酶、PBS）

● 建议使用温和消化试剂（如TrypLE Express）

3.铺板策略

● 进行预实验找到合适的铺克隆梯度，避免单克隆占比太低

● 细胞接种96孔板时需确保细胞分布均匀；外围96孔加入PBS防止蒸发

4.稀释方法

● 使用“极限稀释法”进行铺克隆

● 稀释细胞计数后结果最好落在1*10^6-2*10^6之间

慢病毒感染后的细胞图片

1.细胞生长缓慢或停滞怎么解决？

表现：细胞分裂变慢，长时间不能长满；培养基颜色变化慢

可能原因：
(1)血清问题：血清质量差、浓度过低或批次不一致
(2)细胞问题：传代时接种密度过低、细胞老化（传代次数过多）
(3)环境问题：培养箱温度、CO₂浓度不准确或不稳定
(4)营养耗竭：换液不勤，代谢废物积累

解决方法：
(1)使用优质、预先测试过的胎牛血清，必要时临时提高浓度至15%
(2)确保传代时细胞汇合度达到80-90%，并接种足够的细胞量
(3)定期校准培养箱，确保环境稳定
(4)定期换液（每2-3天），避免细胞过度消耗营养

2.细胞形态改变怎么办？

表现：形化/纤维化：细胞由多边形拉长为长梭形；空泡化：胞质内出现大量透明空泡；颗粒增多：胞质内出现大量暗色颗粒

可能原因：
(1)血清质量差
(2)营养应激：饥饿、换液不勤
(3)毒性应激：药物处理或代谢废物过多
(4)细胞老化或分化

解决方法：
(1)更换优质血清
(2) 增加换液频率，确保营养供给
(3)排查实验体系中是否存在毒性物质
(4)使用低代次细胞，或通过克隆筛选恢复典型形态

3.培养基迅速变黄是怎么回事？

表现：换液后几小时或隔夜后培养基就变为黄色

可能原因：
(1)细胞密度过高：代谢过于旺盛
(2)CO₂浓度偏低：导致培养基偏碱，但细胞代谢产酸使其快速变回黄色
(3)细胞代谢异常

解决方法：
(1)及时传代，切勿让细胞长到100%汇合度
(2)检查并校准培养箱的CO₂供应
(3)增加换液频率

小源提示：Hep 3B细胞因分泌HBV相关抗原， 培养时建议定期更换培养基、避免长时间密闭培养 ，以防代谢产物积累影响细胞活性与状态。

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