Immunity（IF=30.6）| 源井KO 细胞助力解析 FAD 双重抑制 cGAS/RIG-I 的天然免疫调控机制
文献速览
胞质核酸感受器 cGAS、RIG-I 是启动 I 型干扰素天然免疫的核心分子，二者分别识别胞质双链 DNA、双链 RNA 以启动抗病毒与抗肿瘤免疫，但机体持续激活核酸传感通路易诱发自身炎症、细胞衰老等病理损伤；当前领域多单独探索 cGAS 或 RIG-I 的调控因子，能同时双向抑制两大感受器的内源调控分子仍未被发现，代谢物介导的免疫稳态调控机制亟待完善。近日，南湖实验室研究团队于Immunity发表重磅研究，旨在解析机体平衡核酸传感通路激活与免疫耐受的内源代谢调控机制，阐明营养代谢参与天然免疫稳态的全新通路。 该研究使用源井生物提供的 FLAD1敲除A549细胞 作为核心工具模型， 为完整建立 “FLAD1-FAD 抑制 cGAS/RIG-I” 分子因果链条、验证 FAD 的双重抑制功能提供关键细胞支撑。
研究路线
- 代谢物筛选： ISRE 荧光报告系统筛选内源代谢库，锁定 FAD 显著抑制核酸诱导 IFN-I；细胞层面验证 FAD 特异性阻断 polyI:C（RNA）、HT-DNA（DNA）介导 IFN-β 分泌，不影响 TLR 通路激活。
- 上游代谢通路解析： 病毒 / 胞质核酸直接结合 FLAD1、抑制其酶活，下调细胞 FAD 储备；FLAD1 缺失直接解除 FAD 对 cGAS/RIG-I 的抑制，放大 IFN 应答。
- 分子互作与结构机制： SPR、Pull-down、AlphaFold3 分子对接证实 FAD 直接结合 cGAS 催化结构域、RIG-I 解旋酶结构域，占据底物口袋竞争性抑制酶活；明确关键结合氨基酸位点。
- 体外生理功能验证： FLAD1 敲除 / 外源 FAD 回补细胞模型，验证 FAD 缺失增强抗病毒免疫、FAD 补充缓解 DNA 损伤诱导细胞衰老与 SASP 炎症。
- 体内动物表型： 全身 FLAD1 敲除小鼠、髓系特异性 FLAD1 敲除狼疮模型，证实 FAD 缺乏增强体内抗病毒能力、加重自身炎症与狼疮损伤。
- 临床数据佐证： 公共数据库 GSE249619 分析显示 SLE 患者单核细胞 FLAD1 表达显著下调，关联患者高 IFN 炎症表型。
研究机制
主要结果
1.FAD 特异性抑制胞质 DNA/RNA 诱导的 IFN-I 信号，不作用 TLR 通路
细胞实验表明核酸刺激会下调 FAD、上调干扰素，外源 FAD 可剂量抑制胞质 cGAS/RIG-I 通路，且不干扰 TLR 信号。病毒模型中 FAD 预处理减弱抗病毒反应，仅 VB2 可合成功能性 FAD，其余 B 族维生素无此作用；VB2 摄取抑制剂降低 FAD 并放大干扰素信号，反向验证 FAD 的免疫抑制作用。
图1. FAD可特异性抑制胞质核酸诱导的 IFN -I信号通路
2.胞质核酸直接抑制 FLAD1 酶活，下调 FAD 合成，解除免疫刹车
FLAD1 负责催化 FMN 合成 FAD，胞质双链 DNA、RNA 能直接结合 FLAD1 的 N 端结构域，非竞争性抑制其酶活、减少 FAD 生成，TLR 配体不会产生该作用；核酸刺激会梯度降低胞内 FAD，FLAD1 敲除巨噬细胞本底 FAD 更低、干扰素应答更强，回补野生型 FLAD1 或外源 FAD 均可恢复稳态，失活突变 FLAD1 则无挽救效果。
图2.FLAD1活性可被胞质核酸直接抑制，而FLAD1相关的FAD缺乏则会促进 IFN -I信号通路的激活
3.FAD 直接结合 cGAS、RIG-I 催化口袋，竞争性阻断酶活
生化、结构实验证实 FAD 仅特异性结合 cGAS、RIG-I，二者结合亲和力符合生理浓度；FAD 嵌入催化口袋抢占底物位点，依靠芳香残基结合，同源蛋白口袋狭小无法结合。FAD 仅阻断二者上游酶活，不影响下游 STING、TBK 等信号分子激活。
图3.FAD蛋白可靶向核酸传感器，以限制 IFN -I信号传导
图4.FAD可与核酸传感器的催化口袋结合，并抑制其酶活性
4.FLAD1-FAD 轴调控细胞衰老与无菌炎症
DNA 损伤药物（阿霉素 DOX、喜树碱 CPT、H₂O₂）诱导胞内自身核酸释放，激活 IFN 与衰老相关分泌表型（SASP）；外源 FAD 处理显著降低 IFN、SASP 基因表达，减少 SA-β-Gal 衰老阳性细胞。Flad1⁻/⁻胚胎成纤维细胞（MEF）在 DNA 损伤后，衰老、炎症表型大幅加重；补充 FAD 可逆转衰老表型。RNA-seq/GSEA 证明 FLAD 缺失细胞显著富集 I 型干扰素、衰老、炎症通路，FAD 处理可逆转通路富集。
图5.FLAD1相关的FAD可在体外及体内均能抑制自身炎症反应
5.体内动物实验：FAD 缺失增强抗病毒，加剧自身免疫狼疮
利用抗病毒模型（VSV/HSV 感染），研究发现Flad1⁻/⁻小鼠各组织、血清 FAD
含量显著降低；病毒感染后血清 IFN-β、组织 ISG
表达远高于野生型，病毒复制量显著下降，肺部炎症浸润更少，抗病毒能力更强。分离
Flad1⁻/⁻原代巨噬细胞，病毒刺激后 IFN 分泌激增；体外回补 FAD
可抑制过度干扰素释放。
而在咪喹莫特（IMQ）诱导狼疮肾炎模型中，髓系特异性 Flad1 敲除（Lysm-Cre
Flad1fl/fl）小鼠的血清 dsDNA、抗核抗体 ANA、IFN-β、IL-6
显著升高，蛋白尿加重、脾脏肿大、小鼠死亡率上升。这表明髓系细胞 FAD
缺失，自身核酸持续激活 cGAS/RIG-I 通路，慢性 IFN
高表达驱动自身抗体生成与肾脏损伤。
图6.FLAD1相关FAD缺乏可增强体内抗病毒先天免疫应答
研究创新点
1.理论创新
首次发现单一内源代谢物 FAD 可同时靶向 cGAS、RIG 两大胞质核酸感受器，揭示维生素 B2-FLAD1-FAD 全新代谢免疫调控轴，阐明机体依靠代谢分子平衡抗病毒免疫与自身炎症稳态的内在进化机制，填补双向调控核酸传感通路的理论空白。
2.技术创新
综合 SPR 分子亲和力检测、AlphaFold3 结构模拟、定点突变、FLAD1 基因敲除细胞回补体系一套完整生化 - 细胞 - 结构联用技术，精准解析小分子与核酸酶催化口袋结合模式，为抗炎、抗病毒小分子先导化合物的结构设计提供标准化研究范式。
文章小结
本研究证实 FAD 是 cGAS、RIG-I 双重内源抑制物：稳态下 FAD 封锁二者通路维持免疫耐受；胞质核酸积累会抑制 FLAD1、耗竭 FAD，释放抗病毒免疫。细胞与动物实验证明 FAD 缺失可增强抗病毒能力，但诱发衰老、狼疮类自身炎症，补充 FAD 能缓解病变，临床数据也佐证狼疮患者 FLAD 表达偏低。该研究揭示代谢调控核酸传感新机制，为感染、自身免疫及衰老炎症提供代谢靶向治疗方向。
源井生物提供的支持
本研究体外机制验证均依托源井生物提供的FLAD1 Knockout cell line （A549）
开展，清晰搭建 “FLAD 缺失→胞内 FAD 下降→cGAS/RIG-I 通路过度激活”
完整因果链条，有效排除外源核酸、小分子药物带来的脱靶干扰，是完整确立整条
FLAD1-FAD 调控通路不可或缺的核心工具。
源井生物一直秉持“让基因编辑更简单”的核心理念，持续迭代产品与服务，已累计实现13000+基因编辑成功案例，拥有10000+KO细胞产品，基于自主研发的创新技术，基因编辑效率最高可达97%。目前源井生物已为超10000个生命科学实验室、药企和CRO公司提供优质的基因编辑服务与产品。
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