CRISPR筛选挖到增效靶点，BRAF突变结直肠癌联合疗法问世
引言
约10%结直肠癌携带BRAF(V600E)突变，该亚型恶性程度高、现有BRAF抑制剂联合EGFR单抗极易快速耐药，临床治疗手段匮乏。RNA结合蛋白HuR通过调控癌基因mRNA剪接与稳定性，驱动肿瘤增殖、靶向耐药，长期缺乏高效小分子抑制剂。本研究通过化学蛋白组筛选得到CRBN依赖分子胶降解剂dHuR，冷冻电镜解析三元复合物结构，证实dHuR诱导HuR泛素化降解；HuR缺失促使BRAF前体mRNA发生18号外显子跳跃，降低BRAF蛋白、持续抑制MAPK通路，对BRAF抑制剂敏感及耐药肿瘤均有强效杀伤； 激酶CRISPR筛选 发现EGFR/MEK抑制可与dHuR产生协同抗肿瘤效果， 为难治型BRAF突变结直肠癌提供全新靶向降解治疗方案。
研究创新点
- 首次开发靶向RNA结合蛋白HuR的CRBN分子胶降解剂，实现传统“不可成药”RNA结合蛋白高效降解；
- 揭示HuR调控BRAF可变剪接全新机制：HuR结合BRAF内含子17富U元件，维持完整功能BRAF转录本，HuR缺失诱导外显子跳跃生成翻译缺陷截短转录本；
- 阐明dHuR双重抑癌通路：同时下调BRAF、EGFR、VEGF多重癌信号，既阻断MAPK增殖通路又抑制肿瘤血管生成；
- 提出降解HuR可克服BRAF抑制剂反馈性MAPK激活耐药，确立 分子胶联合激酶抑制协同治疗 新理论。
研究路线
- 化合物筛选鉴定： 构建CRBN分子胶文库，结合蛋白组筛选优化得到强效HuR降解剂dHuR-2。
- 结构机制解析： 冷冻电镜解析CRBN-dHuR-HuR三元复合物，明确HuRG58是关键降解基序。
- 细胞药效验证： 细胞水平证明dHuR仅抑制BRAF突变结直肠癌，基因编辑突变株验证靶点特异性。
- 下游分子通路： 多组学、RNA互作实验揭示HuR通过调控BRAF18号外显子剪接维持癌蛋白表达。
- 耐药与联合治疗： dHuR可逆转BRAF抑制剂耐药；激酶CRISPR筛选出EGFR/MEK协同靶点，PDX模型证实单药、联用均安全抑瘤。
研究机制
研究结果
1.高通量蛋白组筛选获得特异性HuR分子胶降解剂dHuR
研究通过构建上万种CRBN结合小分子胶化合物库，HTRF实验筛选大量CRBN高亲和力分子，对比CRBN野生/敲除细胞蛋白组， 特异性筛选出HuR为降解底物； 经构效优化得到dHuR-2，DC50低至3.8nM，仅选择性降解HuR、ZFP91、ZMYM2，不作用Hu家族同源蛋白，蛋白酶体与NEDD8抑制剂可完全阻断dHuR介导HuR降解，证明降解严格依赖CRBN-泛素-蛋白酶体通路。
图1.dHuRs的鉴定
2.冷冻电镜解析CRBN-dHuR-HuR三元复合物，明确HuR降解基序
通过SPR、NanoBRET证实dHuR促进CRBN与HuR结合，3.3Å冷冻电镜显示dHuR苯并呋喃骨架搭建蛋白互作界面，HuRG58环是被CRBN识别的核心降解基序，G58N突变直接破坏三元复合物形成、完全抵抗降解；体外重构泛素反应体系直接证明dHuR诱导HuR多聚泛素化，从结构生化层面阐明分子胶降解分子基础。
图2.CRBN-MGD-HuR三元复合物形成的表征
3.dHuR选择性抑制BRAF突变结直肠癌体内外生长
利用DepMap数据库分析HuR依赖度与BRAF突变高度正相关，13株CRC细胞系证实 dHuR仅强效抑制BRAF突变细胞增殖，BRAF野生型无明显毒性； CRISPR敲除HuR可重现药效，构建G58A降解抵抗HuR突变株、CRBN敲除细胞均完全消除dHuR杀伤作用；Colo205异种移植瘤口服dHuR呈剂量依赖性抑瘤，小鼠体重无下降，体内靶向降解HuR并持续下调MAPK通路，安全性良好。
图3.HuR降解在BRAF突变型结直肠癌中表现出选择性疗效，并抑制了MAPK信号通路
4.HuR通过结合BRAF内含子富U元件调控外显子18可变剪接
研究发现dHuR不改变BRAF总mRNA总量，但大幅诱导BRAF18号外显子跳跃生成X2截短转录本；该转录本翻译效率极低、无法激活ERK；RIP、RNA下拉证实HuR特异性结合BRAF内含子17富U序列，截短/点突变该序列可废除剪接调控；仅人BRAF存在该保守结合序列，小鼠无此调控模式，过表达无内含子持续激活BRAF可部分回补药物杀伤，证明BRAF剪接调控是dHuR核心抑癌机制。
图4.HuR通过直接结合RNA调控BRAF剪接
5.dHuR克服BRAF抑制剂耐药，激酶CRISPR筛选发现EGFR/MEK联用协同效应
通过长期梯度给药构建BRAFi耐药CRC细胞，耐药株仍保持HuR高度依赖，dHuR可持续下调BRAF、EGFR，阻断BRAFi诱导的ERK反馈激活； 激酶组CRISPR敲除筛选显示敲除EGFR、MEK可显著增敏dHuR， 多株细胞与患者PDX模型证实dHuR联合BRAF/EGFR/MEK抑制剂具备协同抑瘤效果，机制上多重阻断MAP通路、同时降低VEGF抑制肿瘤血管生成。
图5.HuR降解通过持续抑制通路克服BRAFi耐药性
文章小结
本研究筛选并优化靶向HuR的CRBN分子胶降解剂dHuR，解析三元复合物晶体结构，阐明HuR通过结合BRAF内含子调控可变剪接维持癌蛋白表达的全新机制；dHuR特异性杀伤BRAF突变结直肠癌细胞，有效克服BRAF抑制剂临床耐药，动物模型口服安全抑瘤； 激酶CRISPR筛选确立dHuR联合EGFR/MEK抑制剂协同治疗策略，打通分子胶降解剂用于难治BRAF突变肠癌的转化路径， 为RNA结合蛋白不可成药靶点开发提供完整研究范式。
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