干货丨ARPE-19细胞培养和基因编辑Tips

ARPE-19细胞源自人类视网膜色素上皮组织，来源于一名在机动车事故中死于头部创伤的19岁男性的正常眼睛。该细胞系保留色素合成、吞噬光感受器外节等核心功能，且体外培养稳定、传代高效，被广泛应用于视网膜退行性疾病机制、眼内炎症调控、眼部药物筛选及视网膜修复研究，是眼科学基础与研发领域不可或缺的经典细胞模型。小源现在就奉上ARPE-19细胞独家培养秘籍，带大家一次性解锁ARPE-19细胞的培养技巧与基因编辑实操要点！

一、人视网膜色素上皮细胞(ARPE-19)基本信息

• 细胞名称： 人视网膜色素上皮细胞(ARPE-19)
• 细胞形态： 上皮样细胞，贴壁生长
• 细胞培养条件： 90%DMEM/F12+10%FBS
• 气相： 空气，95%；二氧化碳，5%
• 温度： 37℃
• 换液频次： 2-3天/次
• 传代比例： 1:3-1:4

细胞生长状态参考：

• 正常状态： 细胞呈多角形至不规则多边形；细胞之间连接紧密， 单层、铺路石样 单层排列；细胞排列有序，边界清晰。（见下图）

• 异常状态： 细胞体积增大、拉长，变得不规则；细胞萎缩、变圆，贴壁不牢；细胞碎片增多或胞质内出现透明空泡。（见下图）

二、ARPE-19细胞复苏流程

• 准备培养基
  取7mL完全培养基于离心管中备用。
• 细胞解冻
  将细胞从干冰里取出，用镊子夹住盖子放入 37℃水浴中快速晃动（注意：水不能没过盖子），使其在1分钟左右完全融化，直至冰块融化至绿豆大小，停止水浴。
• 细胞离心
  将解冻后的细胞悬液转移至离心管中，1100rpm条件下离心4分钟，弃去上清液。
• 重悬与接种
  用完全培养基重悬细胞，接种于合适大小的培养皿或培养瓶中。
• 细胞培养
  将培养皿或培养瓶置于37℃培养箱中培养，24小时后观察细胞状态及贴壁情况。

三、ARPE-19细胞传代步骤（以T25瓶为例）

1. 传代条件

• 当细胞汇合度达到80-90%时可进行传代。
• 传代时在超净台内弃去培养瓶里的培养液，加入5mLPBS洗涤细胞1-2次。

2. 胰酶消化

• 加入1mL胰酶，轻轻晃动瓶子并使胰酶完全浸过细胞
• 将培养瓶放入培养箱孵育 2-3分钟。
• 待在显微镜下观察到大部分细胞变圆变亮，轻轻晃动培养瓶两侧有大部分细胞脱落时，立即终止消化。

3. 终止消化

• 加入2倍胰酶体积即2mL完全培养基终止消化。
• 然后转移至15mL离心管中。

4. 细胞悬液离心

• 1100 rpm 室温离心 4 分钟。
• 离心结束，弃去上清，加入完全培养基重悬细胞。

5. 传代培养

• 细胞按照1:2-1:3比例传代。
• 传代第二天观察细胞状态。

四、ARPE-19细胞冻存步骤

• 收集细胞
  按照细胞传代的过程收集消化好的细胞到离心管中。
• 离心
  1100rpm条件下离心4分钟，去掉上清。
• 重悬与冻存
  用细胞冻存液重悬细胞，按每1mL冻存液含1×10^6个细胞/mL分配到冻存管中，标注好名称、代数、日期等信息。
• 降温与储存
  将冻存管置于程序降温盒中，-80℃冰箱中过夜后转入液氮罐内保存。

五、ARPE-19细胞培养注意事项

• 细胞状态： 在细胞生长至80-90%汇合度时传代最佳。
• 对于生长中的细胞，每2-3天更换一次新鲜完全培养基。
• 培养基保存： 确保培养基储存于4°C避光，并在有效期内使用。
• 培养环境： 确保细胞培养环境正常。
• 操作细节： 操作前需预热培养基和胰酶至37℃，避免温度应激。
• 细胞传代操作： 避免过度吹打而造成细胞膜的损伤；贴壁不均匀时可轻摇培养瓶使细胞分布均匀。

六、ARPE-19细胞转染时注意事项

1. 细胞状态要求

• 确保细胞状态良好，使用处对数生长期即 汇合度在70-80% 的细胞。
• 细胞 活率＞85%， 可通过台盼蓝进行检测。
• 使用 低代次细胞。
• 注意细胞消化时间， 避免过度消化， 对细胞造成伤害。
• 实验过程中细胞要吹打成 单细胞， 避免细胞聚团。

2. 转染试剂与预实验

• 转染试剂使用前需要充分混匀保证其均匀性。
• 建议进行药筛预实验找到 最佳药筛浓度， 以便于转染后进行药筛。

3. 电转法

• 控制细胞量，电转后根据细胞量接种至合适的培养板里。
• 使用温和的胰酶，并用含血清的培养基彻底终止消化。
• 用PBS洗涤细胞1-2次，彻底去除残留血清，避免离子干扰电穿孔。
• 进行预实验对电转参数进行优化。
• 保证电转后细胞 贴壁率≥70%。
• 控制实验时间，电转全程不宜过长。

4. 慢病毒法

• 进行预实验找到最合适的MOI。
• 感染病毒前细胞汇合度控制在30-40%之间，不可过高。
• 感染前添加助染剂Polybrene。
• 感染后24h进行换液。
• 感染使用的病毒液避免反复冻融。
• 若感染效率过低可进行复感染（需确保细胞对病毒耐受性良好）或尝试使用离心法感染。

5. 脂质体法

• 选择适合的脂质体转染试剂，通过预实验重新优化DNA/试剂比例，确定最佳转染条件。
• 使用增强剂：有些试剂系统提供专门的增强剂，可以显著提高在某些难转染细胞中的效率。
• 在制备脂质体-DNA复合物时，使用无血清培养基，如Opti-MEM。血清会干扰复合物的形成，导致沉淀和效率低下。
• 转染前24h进行细胞铺板，转染前细胞汇合度控制在60-70%。
• 先稀释DNA于Opti-MEM，再加脂质体 （反向混合会失效）。
• 室温静置15-20分钟（＜10分钟复合不充分，＞30分钟毒性增加）。
• 转染培养基中严禁添加抗生素，因阳离子脂质体可增加细胞通透性，导致抗生素进入细胞引发毒性。
• 复合物添加时应均匀、缓慢地滴加到培养基里，并轻摇混匀，避免直接冲击细胞，切忌剧烈吹打。

七、ARPE-19细胞铺单克隆实验注意事项

1. 细胞状态要求

• 使用对数生长期的细胞进行铺克隆，铺克隆前细胞汇合度建议控制在70%左右。
• 铺克隆时细胞活率≥80%。

2. 试剂与预实验

• 提前预温所有试剂（包括培养基、胰酶、PBS）。
• 建议使用温和消化试剂（如TrypLE Express）。

3. 铺板策略

• 进行预实验找到合适的铺克隆梯度，避免单克隆占比太低。
• 细胞接种96孔板时需确保细胞分布均匀；外围96孔加入PBS防止蒸发。

4. 稀释方法

• 使用“极限稀释法”进行铺克隆。
• 稀释细胞计数后结果最好落在1*10^6-2*10^6之间。

电转后细胞图

八、ARPE-19细胞培养常见问题及解决方案

1. 细胞生长缓慢怎么办？

表现： 细胞增殖速度远低于正常（正常 2-3 天传代一次）。

可能原因：

• 细胞状态老化：细胞传代次数过多，活力下降。
• 接种密度过低：细胞汇合度太低，难以形成良好的生长环境。
• 培养条件不佳：培养箱温度、CO₂浓度不准确或不稳定。
• 支原体污染：导致细胞生长缓慢的最常见隐性污染。
• 培养基成分不适：未使用适合ARPE-19的培养基（如DMEM/F12），或血清质量不佳（如血清等级不足、批次差异）。

解决方法：

• 控制传代次数，避免细胞过度传代，在细胞处于对数生长期内进行传代；复苏低代次细胞重新培养。
• 调整接种密度：根据细胞生长特性，调整接种密度至适宜范围。
• 检查培养箱参数设置是否正确，确保温度、CO₂浓度、湿度等条件适宜。
• 进行支原体检测：若阳性，建议丢弃该批次细胞，重新复苏早期冻存的细胞，或使用支原体清除试剂（但可能改变细胞特性）。
• 使用含10%优质胎牛血清（FBS）的DMEM/F12培养基，避免频繁更换血清品牌。

2. 细胞形态异常如何解决？

表现： 细胞皱缩、边缘不清晰；细胞变大、颗粒增多、空泡增多、上皮样变为成纤维样。

可能原因：

• 血清质量差或细胞老化。
• 营养不足或消化过度，传代比例过低。
• 代谢废物积累（培养过久）。

解决方法：

• 使用经过验证的优质胎牛血清，避免使用来源不明的血清；复苏早期冻存的代次低的细胞株。
• 更换新鲜培养基，调整胰酶消化时间（一般2-3分钟）；使用更适宜的传代比例（如1:3或1:4），确保细胞在接种后能较快接触并形成单层。
• 及时传代和换液，不要在细胞长满100%后才处理，在80%-90%密度时传代最佳。

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