CRISPR基因编辑技术服务
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红棉 · 基因敲除计划
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急性白血病可分为急性髓细胞白血病（Acute myeloid leukemia，AML）和急性淋巴细胞白血病（Acute lymphoblastic leukemia，ALL）两种，是成人最常见的血液肿瘤之一。其发病是由于造血干细胞发生恶性增殖并且失去正常分化成熟的能力，使得造血细胞正常功能受到抑制，导致贫血、出血以及免疫力低下等严重后果。近几年来，由于CRISPR技术的发展，尤其是CRISPR文库筛选的应用，使得大量的急性白血病相关治疗靶点被发现，多种新型的靶向药物如IDH1/2抑制剂、FLT3抑制剂、BCL-2抑制剂以及CPX-351等逐步进入临床，引发了急性白血病治疗从化疗转向靶向治疗的重大变革[1-2]。那么CRISPR文库筛选到底是如何应用在急性白血病的研究中的呢，小源为大家整理了几篇高分文献，快一起来学习一下吧！
1. 寻找AML细胞生长必须基因
对于CRISPR文库筛选，最直接的用法就是筛选细胞生长必须基因，但是为了确保筛选结果的可靠性，最好是使用多种不同细胞系并结合In vivo模型同步筛选。Lin等人通过数据库筛选后，选择了200个在AML细胞系中具有生长依赖的基因，并构建了对应的AML细胞生长依赖基因敲除文库。借助此文库筛选两种不同的AML细胞系MV4-11和U937以及一种肿瘤异种移植模型PDX（patient-derived xenograft）后，研究者们发现SLC5A3以及MARCH5基因在三种文库筛选模型中均被显著下调（图1）。进一步通过分别构建这两个基因敲除的AML细胞系进行下游机制研究，他们发现SLC5A3通过转运肌醇支持AML细胞的增殖，而MARCH5基因则会阻止AML细胞发生凋亡[3]。
图1 MARCH5和SLC5A3基因在CRISPR文库筛选中均被显著下调[3]
2. SUSD6基因促进AML细胞产生免疫逃逸
除了筛选细胞生长必须基因外，使用CRISPR文库筛选耐药基因也是常见手段。免疫检查点疗法是一种通过阻断T细胞激活的抑制信号，来促进抗肿瘤的免疫反应，从而实现肿瘤治疗的方法，然而某些肿瘤对ICT具有原发耐药或产生适应性抵抗，导致IDT对这些类型的肿瘤治疗无效。为了探究肿瘤细胞对IDT的耐药性机制，研究团队以人AML细胞系THP-1以及鼠AML细胞系RN2作为研究对象，使用全基因组敲除文库结合流式分选的方法，通过筛选带荧光标记的肿瘤抗原高表达细胞，发现SUSD6基因在两个AML细胞系中均被显著富集（图2），说明SUSD6基因敲除后会促进肿瘤抗原的表达，从而增强免疫检查点疗法的疗效。研究团队随后也通过在细胞中敲除SUSD6基因并进行In vivo实验后，发现SUSD6基因通过抑制AML细胞的MHC-I表达以及其免疫原性，促进细胞对T细胞产生免疫逃逸反应[4]。
图2 SUSD6基因在两个细胞系的肿瘤抗原高表达类群中均被富集[4]
急性淋巴细胞白血病可细分为急性T淋巴细胞白血病（T-ALL）以及急性B淋巴细胞白血病（B-ALL）两种，二者占急性白血病的比例约30%。虽然ALL的发病率较AML低，但是相比于AML，ALL的治疗难度更大，预后差，目前尚无FDA批准的ALL治疗方法。
1. T-ALL中缬氨酸-tRNA合酶显著上调
tRNA生物合成的紊乱常见于肿瘤细胞中，然而在T-ALL中是否也存在tRNA生物合成紊乱的现象仍然未知。为了探究上述问题，Thandapani等人使用tRNA生物合成相关基因的敲除文库对两个不同T-ALL细胞系CUTLL1和Jurkat进行筛选后发现，负责缬氨酸tRNA合成的基因VARS在这两个细胞中均被显著下调（图3）；同时对T-ALL样本进行分析的结果表明VARS的mRNA表达量显著上调。以上结果均说明在T-ALL中，缬氨酸tRNA生物合成发生紊乱。为了进一步验证缬氨酸tRNA生物合成的作用，研究者们在细胞系中基因敲除VARS基因或在动物水平通过饮食限制缬氨酸的摄入，均能显著抑制T-ALL增殖并改善T-ALL症状[5]（图4）。
图3 VARS基因在CRISPR文库筛选中均显著下调[5]
图4 限制缬氨酸摄入显著改善T-ALL小鼠症状[5]
B-ALL细胞中跨膜蛋白CD19的表达缺失使得B-ALL对CAR-T疗法产生耐药性，然而CD19的表达是如何被调控的仍然未知。为了探究这一问题，Witkowski等人使用全基因组敲除文库对3个不同的B-ALL细胞系Reh、697和NALM6进行筛选，结合流式细胞术分选出CD19高表达和低表达的两个细胞类群并进行NGS测序分析后，研究团队发现NUDT21基因在这三个细胞高表达CD19的细胞群中均被显著富集，说明NUDT21基因负调控CD19的表达（图5）。在确认B-ALL中NUDT21高表达后，研究团队使用CRISPR/Cas9系统构建了该基因敲除的B-ALL细胞系，发现NUDT21基因会直接抑制CD19 mRNA的稳定性及其蛋白表达[6]。
图5 NUDT21作为CD19抑制因子被显著富集[6]
CRISPR文库筛选技术发展至今已有10年时间，借助CRISPR文库筛选已在多个不同领域发现了大量全新的靶点，也由此产生了诸多高分文章。通过以上案例不难看出，近几年来，借助CRISPR文库发表的高分文章一般有如下几个共通点：1. 针对某一类疾病使用多种不同细胞系同步筛选，通过比较分析找出靶点；2. 在找出靶点后，构建基因敲除细胞系进行验证，并展开下游机制研究。除此之外，使用更小的sgRNA文库、结合流式分选以及动物实验更容易让你的研究获得reviewer的青睐。
为了帮助各位研究者们完成更好的研究、发表高质量文章，小源也特地为大家整理了一下急性白血病中常用的各种细胞系（表1），如果您有研究急性白血病的需求，赶紧收藏起来吧！
表1 急性白血病常用细胞系
白血病类型 | 种属 | 常用细胞 |
AML | 人 | THP-1*、MV4-11、U937、OCI-AML5 、MOML13、MOML14、HL-60 |
鼠 | RN2、C1498、EL9611、RAW264.7* | |
T-ALL | 人 | Jurkat*、CUTTL1、Hut78、JM、CCRF-CEM |
B-ALL | 人 | NALM-6、REH、697、BALL-1、EHEB |
