上调TREX1减少DNA片段积累或成类风湿性关节炎防治新策略！

上调TREX1减少DNA片段积累或成类风湿性关节炎防治新策略！

背景

类风湿性关节炎(Rheumatoid arthritis, RA)是一种慢性全身性自身免疫疾病，发病机制尚不清楚。研究表明，年龄、吸烟史、不良体质指数(BMI)、免疫原性和基因多态性等多种因素都与RA的发病机制及其难治性有潜在关系。作为生命中不可避免的过程，衰老是各种疾病风险日益增加的一个主要因素。

代谢性DNA损伤和免疫系统的持续激活是驱动细胞衰老的重要生物学活动。在衰老过程中，DNA片段会在血液中积累并进入循环，成为循环自由DNA (cfDNA)。值得注意的是，DNA片段化也被认为是许多疾病的生物学特征，如创伤、败血症、无菌性炎症、心肌梗死、中风、移植排斥反应、糖尿病、镰状细胞病等。Aicardi-Goutières综合征和家族性冻疮狼疮都有一个共同的表型特征——因不能及时清除self-DNA或self-RNA片段而导致免疫系统被异常激活。经缓解病情抗风湿药(DMARDs)治疗后，RA患者血浆中的DNA片段化情况明显降低，这说明DNA片段化可能与RA发病机制相关。基于中老年人RA发病率升高可能与年龄相关的DNA片段积累有关的假设，弄清这些患者血浆中DNA片段的来源、研究如何提高清除机制效率可能为RA的防治策略开辟新途径。

为验证DNA片段是导致类风湿性关节炎发生的因素之一，来自澳门科技大学创新药物发现生物物理实验室、中药质量研究国家重点实验室的Weidan Luo研究团队做了一系列的研究并在Research Square上发表了一篇题为：“Self-DNA accumulation as a risk factor for accelerating the pathogenesis of rheumatoid arthritis in elderly individuals”的文章。该文章称DNA片段是炎症释放介质的有效制造者，而TREX1基因是DNA片段的有效降解者，并提示TREX1是调节细胞免疫和衰老的关键基因。这一结论为我们提供了一个预防类风湿性关节炎的新思路，即快速清除体内多余的DNA片段可确保衰老细胞保持健康。

3'->5' DNA外切酶TREX1在RA患者中显著下调

为了研究DNA片段的积累是否会刺激异常的免疫反应，作者首先测定了健康志愿者、类风湿关节炎(RA)患者和骨关节炎(OA)患者外周血标本中TREX1 (DNA片段清除酶)和cGAS (DNA片段传感器)的基因表达水平。图1A 和图1 B结果显示，与健康对照组和OA患者相比，RA患者TREX1基因表达水平明显降低，而cGAS基因表达水平明显升高，提示DNA片段积累与人类RA发病密切相关。图1C表明，与年幼的对照大鼠(4周龄)相比，健康老年大鼠(>12月龄)的血液样本中TREX1和cGAS的转录水平都很高。此外，TREX1的高表达能清除老年大鼠过量的DNA片段，可以防止异常的免疫反应，维持动物的健康状态。

图 1

TREX1和cGAS信号通路在DNA片段诱导的促炎因子释放中的作用

研究人员将DNA片段转染到RA-FLSs (类风湿关节炎成纤维样滑膜细胞)可刺激DNA片段清除酶TREX1和cGAS-STING的表达，并上调促炎细胞因子(TNF-α, IL-1β, IL-2, IL-6, IL-8, IL-25 and IFN-β)表达，且都呈剂量依赖性(图1D & E)。然而，TREX1、cGAS-STING和促炎因子的表达增长仅发生在转染DNA片段后24小时内，在转染48至72小时后这些被激活的基因表达会下降。因此，作者推测，DNA片段诱导的TREX1上调可能有助于清除积累在细胞质的DNA片段，降低cGAS-STING和促炎因子水平。

不仅如此，Western blot结果也证实：在RA-FLSs中引入DNA片段，TREX1和cGAS蛋白的表达呈时间和剂量依赖性(图2A)。为了揭示TREX1和cGAS-STING信号通路在DNA片段诱导的炎性反应中的作用，在转染DNA片段前，用siRNA沉默RA-FLSs中的TREX1和cGAS，并构建了cGAS敲除RA-FLSs。如图2B所示，沉默TREX1基因表达激活了cGAS-STING信号，进一步促进转染了DNA片段的RA-FLSs中促炎性细胞因子的释放，而敲除cGAS会显著下调cGAS-STING信号、抑制DNA片段诱导的促炎性细胞因子释放。这些结果证实DNA片段会激活炎症反应，且TREX1和cGAS均在DNA片段介导的炎症反应中发挥调控作用。

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图 2

关节注射DNA片段诱发TREX1条件敲除(TREX1^Cre)大鼠关节炎

为阐明TREX1在AIA模型中DNA片段致病机制中的作用，作者通过CRISPR/Cas介导的基因组编辑，在SD大鼠中完成了Cre-loxP介导的TREX1条件敲除(TREX1^Cre)，其中Cre腺相关病毒由源井生物提供。图3A-C结果显示在TREX1^Cre/+ AIA大鼠和健康对照TREX1^Cre/+大鼠后肢关节腔内注射200ug DNA片段后，大鼠均出现严重的后爪肿胀、红斑和关节僵直。TREX1基因敲除或下调可能会增加对照组和后肢关节注射DNA片段的AIA大鼠关节炎的严重程度，研究结果提示TREX1可能通过清除关节组织中的cfDNA对RA有良好的治疗作用。

图 3

DNA片段可促进TREX1^Cre大鼠T细胞活化，减少Treg细胞数量

为检测DNA片段对大鼠自身免疫反应的影响，将超声诱导的大鼠肌肉DNA片段经尾静脉注射至健康对照TREX1^Cre/+大鼠和AIA模型TREX1^Cre/+大鼠。与上述实验结果一致的是，注射DNA片段的健康对照TREX1^Cre/+大鼠和AIA模型TREX1^Cre/+大鼠后肢关节肿胀越严重，关节炎评分明显越高，骨破坏越严重。流式细胞仪分析结果显示，AIA TREX1^Cre/−模型大鼠CD8⁺ T淋巴细胞数量明显增加，Treg细胞数量明显减少。静脉注射DNA片段后，AIA模型TREX1^Cre/+ (Cre H/L)大鼠和健康对照TREX1^{Cre/+ (Cre H/L)}大鼠与健康对照TREX1野生型大鼠相比，CD8⁺ T淋巴细胞数量增加，Treg细胞数量减少。

图 4

腺相关病毒(AAV)介导的TREX1过表达抑制AIA大鼠滑膜炎症

为进一步研究TREX1在大鼠AIA发病机制中的作用，将表达TREX1的腺相关病毒(AAV-TREX1)注射到大鼠关节腔(2.5×10¹⁰ PFU或2.5×10⁸ PFU)或尾静脉(1.0×10¹¹ PFU或1.0×10⁹ PFU)，其中TREX1腺相关病毒由源井生物提供。注射AAV-EGFP的AIA大鼠(对照)后爪出现严重肿胀、红斑和关节僵直。AIA大鼠关节腔和尾静脉注射AAV-TREX1后，关节炎评分和后爪体积均显著降低，提示过表达TREX1的大鼠AIA的严重程度显著降低，表明TREX1可能通过清除DNA片段在AIA大鼠关节炎的发生中发挥抑制作用。

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图 5

老化相关的细胞衰老和关节炎导致c-Jun/c- Fos转录因子表达失衡和TREX1表达抑制

为了进一步证明E2F1在TREX1表达中的作用，作者发现，E2F1在RA-FLSs中呈剂量依赖的过表达，TREX1和DP-1 (E2F转录因子的重要激活因子)的转录水平显著且逐渐升高。与此同时，紫外线介导的DNA损伤和DNA片段直接攻击诱导了E2F1、DP-1、c-Jun和c-Fos的表达，同时TREX1在RA-FLSs中以时间依赖性的方式上调。然而，E2F1 siRNA的存在显著抑制了TREX1的高表达，表明E2F1是TREX1的关键转录因子。为了进一步阐明TREX1在衰老和RA中的调控作用，作者测定了在转染DNA片段的早期和晚期传代的RA-FLSs中TREX1和AP-1复合物组分(c-Jun/c-Fos)的表达。无论DNA片段转染成功与否，TREX1在晚期传代RA-FLSs中表达量均显著低于早期传代RA-FLSs。siRNA敲降c-Fos显著抑制DNA片段介导的TREX1在早期传代RA-FLSs中的表达。无论是在老化相关的细胞衰老中，还是在关节炎条件下，通过抑制TREX1的转录因子，如E2F1和AP-1, TREX1的表达，都能促进cfDNA的积累，从而激活自身免疫反应。

图 6

综上所述，该文章首次阐述了：① DNA片段可能是诱发RA的潜在免疫原性因子 ②TREX1的下调会促进促炎因子的释放，并可能参与RA患者DNA片段的积累，从而激活cGAS/STING信号通路进一步加剧炎症反应。除此之外，该文章还将自身免疫组织炎症与衰老联系起来，将DNA片段的有效清除划定为治疗和预防RA和衰老相关疾病的重要策略。

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